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第45卷第6期
               ·818 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年6月


              1.2  方法                                           CNV变异的分类标准参考ACMG 和ClinGen 的CNV
                                                                                     ［5］
              1.2.1 临床表型的收集和标准化                                 的解释和报告技术标准 。变异的生物学分级参照
                  通过医院内部临床信息登记系统及重点实验                           ACMG标准分为5个等级：致病性（pathogenic，P）、可
              室的遗传病患儿本地化数据库管理系统收集患者                             能 致 病 性（likely pathogenic，LP）、临 床 意 义 不 明
              的临床资料，临床表型按照中文人类表型标准用语                           （variant of uncertain significance，VUS）、可 能 良 性
             （The Chinese Human Phenotype Ontology，CHPO）转化     （likely benign，LB）和良性（benign，B）。本研究中明
              成标准表型词进行统计（http：//www.chinahpo.org/）。             确分子诊断的阳性患儿包括 P 和 LP 两个等级的序
              1.2.2 WES方法                                       列变异和CNV。
                  先证者模式 WES 单独对患儿外周血 DNA 进行                     1.2.5 一代测序（Sanger测序）
              检测，家系 WES（Trio⁃WES）对患儿及父母外周血                           采用 Sanger 测序对 WES 检测到的变异进行验
              DNA进行检测。①DNA提取：采集乙二胺四乙酸二钾                         证，以确认数据可靠性及变异来源。针对目标基因
             （dipotassium ethylene diamine tetraacetate，EDTA⁃K2）  突变位点，设计特异性引物，使用 TAKARA EXTaq
              抗凝外周血2 mL，使用血液基因组柱式中量提取试                          酶（50 μL PCR 体系）扩增患儿及其父母样本的DNA
              剂盒（天根）提取基因组 DNA。②文库构建：采用                          片段，经纯化后，通过ABI 3730 XL测序仪进行测序分
              IDT公司xGen Exome Research Panel v2.0捕获探针           析。序列比对与结果判读采用SnapGene软件完成。
                          ®
              与 gDNA 文库序列进行液体杂交，将目标区域 DNA                       1.3  统计学方法
              片段富集，构建全外显子文库，覆盖人基因组中                                  采用SPSS29.0软件进行统计学分析，计量资料
              19 396 个基因的编码区及部分非编码区。③测序：                        的正态性通过 Kolmogorov⁃Smirnov 检验判定（P≥
              通过 illumina 公司 NovaSeq 6000 系列测序仪进行高              0.05 为符合正态分布），偏态分布数据以中位数（四
              通量测序（PE150）。                                      分位数）［M（P25，P75）］表示，计数资料用例数（百分
              1.2.3 测序数据与分析                                     率）［n（%）］表示。组间比较采用χ 检验，P < 0.05为
                                                                                               2
                  将测序序列与 Ensembl 参考基因组 GRCh37/                  差异有统计学意义。
              hg19比对，使用GATK软件分析出SNP、Indel。对检
                                                                2  结 果
              测到的高质量变异进行各大数据库（如dbSNP、千人
              基因组、ExAC、ESP等频率数据库及OMIM、HGMD、                     2.1  1 096例患儿临床表型结果
              ClinVar 等）的关联注释。借助 Provean、SIFT、Poly⁃                  1 096例确诊患儿有234例（21.35%）为ID，862例
              phen2⁃HVAR、Polyphen2⁃HDIV、M⁃Cap、Revel、Muta⁃      （78.65%）为 GDD。61 例（5.57%）患儿合并特殊面
              tiontaster 等蛋白结构预测软件，MaxEntScan 剪切位               容，134例（12.23%）合并EP，245例（22.35%）脑部影
              点预测软件等对其危害性进行分析，筛选出对蛋白                            像显示有异常，ASD 120 例（10.95%），ADHD 294 例
              结构可能有害的变异。将测序序列与参考序列                             （26.82%），手足异常135例（12.32%），心脏异常77例
              hg19 基因组对比，100 kb 及以上区间大小的拷贝数                    （7.03%），肾脏及泌尿系统异常 19 例（1.73%），生殖
              变 异（copy number variation，CNV）使 用 CANOE、          系统异常15例（1.37%）。
              CNVnator、DeviCNV、ExomeDepth方法对外显子区域               2.2 全外显组测序结果
              深度均一化，并与（同测序批次）对照样本比较得到每                               在 1 096 例 ID/GDD 患儿的遗传学分析中，基于
              个区间的拷贝值，之后将邻近区域相同拷贝值的外显                           WES 结果，共检出 271 例患儿携带已知致病单基因
              子进行连接获得100 kb及以上区间大小的CNV。分                        变异和116例患儿携带CNV。在271例携带已知致
              析 CNV 区间所包括的基因，关联 Decipher、ClinVar、               病单基因变异患儿中共检出287个变异，其中138个
              OMIM等相关数据，注释已报道的疾病基因。根据注                          P 等级，149 个 LP 等级。116 例 CNV 患儿中共检出
              释信息、频率数据库等综合评定CNV危害等级。同                           118个变异，包括102个P等级，16个LP等级。依据
              时通过WES整体数据的分析评估患儿染色体核型。                           检出 P 和 LP 两个等级的序列变异和 CNV 为阳性诊
              1.2.4 变异的分类                                       断原则，WES在ID/GDD中单基因变异阳性诊断率为
                  序列变异调用和筛选参考既往研究和美国医                           24.73%（271/1 096）。WES在ID/GDD中的CNV阳性

              学遗传学与基因组学学会（American College of Med⁃              诊断率为 10.58%（116/1 096）。笔者中心该组 ID/
              ical Genetics and Genomics，ACMG）临床指南     ［3- 4］ ，  GDD患儿中总体阳性诊断率为35.31%（387/1 096）。
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