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第45卷第7期               沈埝萱，孙陈晨，孔灵杰，等. ST3GAL3在食管鳞癌中的作用与机制研究［J］.
                  2025年7月                    南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（7）：925-935，944                     ·927 ·


                液、Trizol 试剂、青霉素⁃链霉素溶液、PBS、TBST、脱                  养条件37 ℃和5% CO2。
                脂奶粉、PCR引物、干扰序列（上海生工生物公司），                         1.2.4  质粒构建
                4%多聚甲醛固定液和结晶紫染色液（上海碧云天                                pLVX⁃Puro⁃Control（Con）、pLVX⁃Puro⁃ST3GAL3⁃
                公司），DNA Marker、蛋白Marker、ECL Western 印迹底           WT和pLVX⁃Puro⁃ST3GAL3⁃Mutant（A320P和D370Y）
                物、Western blot一抗剥离液（Thermo Fisher Scientific，     过表达质粒以及pLVX⁃Hygro⁃ST3GAL3⁃WT和pLVX⁃
                美 国），SDS⁃PAGE 凝 胶 配 制 试 剂 盒（上 海 雅 酶               Hygro⁃ST3GAL3⁃Mutant（A320P和 D370Y）回复表达
                公 司 ），ECM 组 分（ 包 括 Collagen、Fibronectin 和         质粒由苏州泓迅生物科技有限公司构建。
                Laminin，Merck Millipore公司，美国），限制性内切酶                  利用pLKO.1⁃Puro 载体经过酶切、链接、测序等
                和 T4 连接酶（NEB 公司，美国），Stbl3 感受态细胞                   步骤构建 ST3GAL3 的干扰表达质粒。具体靶向干
               （深圳康体生命公司），Transwell 小室（Corning 公                  扰序列如下：ST3GAL3⁃shRNA#1，5′⁃ GTGTTTGGT⁃
                司，美国），MAM⁃琼脂糖（J⁃OIL MILLS 公司，日                    GTATTATCATTT⁃3′；ST3GAL3⁃shRNA#2，5′⁃GAAT⁃

                本），ST3GAL3 抗体（Abcam 公司，美国）、β⁃actin                TGACGACTATGACATTG⁃3′。
               （Santa Cruz Biotechnology公司，美国），p⁃FAK、FAK、         1.2.5  慢病毒包装及稳转细胞系构建
                Integrin α5 和 Integrin β1 抗体（CST 公司，美国）。              将 ST3GAL3 相关过表达及干扰慢病毒载体与

                Pierce TM  BCA 蛋 白 质 测 定 试 剂 盒（Thermo Fisher      psPAX2 和 pMD2.G 包装质粒通过 PEI MAX 共同转
                Scientific公司，美国），iScript cDNA逆转录合成试剂              染至HEK⁃293T细胞中。瞬转12 h后换新鲜完全培
                盒、SYBR Creen PCR 试剂盒（Bio⁃Rad 公司，美国），              养基，48 h 和 72 h 后分别收集过滤分装慢病毒上清
                mini、midi 质 粒 提 取 试 剂 盒 以 及 胶 回 收 试 剂 盒           液，-80 ℃保存备用。
               （QIAGEN 公司，德国），免疫组化试剂盒（Vector                          利用上述病毒上清液感染相应ESCC细胞2~3 d
                Laboratories公司，美国）。                               后，通过嘌呤霉素或潮霉素B对细胞进行杀伤筛选，
                1.2  方法                                           最终获得相应抗性的稳转ESCC细胞。
                1.2.1  免疫组化（immunohistochemistry，IHC）             1.2.6  qRT⁃PCR
                    取石蜡包埋的组织切片，60 ℃烘片 90 min 后，                       称取新鲜食管癌和癌旁组织，加入TRIzol试剂，
                脱蜡、水化，置于柠檬酸修复液中进行高压抗原修                            按说明提取总RNA，通过逆转录合成试剂盒逆转录
                复，95 ℃ 15 min。PBS 缓摇洗片 2 次，每次 5 min。              RNA，采用 SYBR Creen PCR 试剂盒进行 qRT⁃PCR。
                加 ST3GAL3 一抗 4 ℃孵育过夜，PBS 缓摇洗片 3 次，                以GAPDH 为内参基因进行分析。基因引物序列见
                每次 5 min。二抗 37 ℃孵育 30 min，PBS 缓摇洗片                表1。
                3 次，每次 5 min。滴加 3，3⁃二氨基联苯胺盐酸盐                               表1 qRT⁃PCR相关的引物序列
               （DAB）显色（镜下及时观察显色情况终止显色），苏                                 Table 1 Primer sequences for qRT⁃PCR
                木素复染，最后脱水、封片、晾干、镜检拍照。利用                             Gene                      Sequence
                免疫反应性评分系统（immunoreactive score，IRS）分              ST3GAL3 Forward 5′⁃GCCTGCTGAATTAGCCACCAAG⁃3′
                          ［10］
                析染色结果 。                                                    Reverse 5′⁃CCACTTGCGAAAGGAGTCATCC⁃3′
                1.2.2 GEO数据库中数据集分析                                GAPDH    Forward 5′⁃GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT⁃3′
                    从GSE119436、GSE130078和GSE11011数据集                       Reverse 5′⁃GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG⁃3′

               （Gene Expression Omnibus，GEO，https：//www.ncbi.     1.2.7  蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）
                nlm.nih.gov/gds）中检索分析ST3GAL3基因的表达谱。                   收取细胞样品，RIPA 裂解液提取总蛋白，BCA

                    使用 CCLE 在线数据库（https：//sites.broadinsti⁃       试剂盒测定蛋白浓度，SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分
                tute.org/ccle）分析比较 ST3GAL3 基因在相关食管癌               离蛋白，转移到 PVDF 膜上。5%脱脂奶粉/TBST 室
                细胞系中的表达情况。                                        温缓摇封闭 1 h，TBST 洗膜，一抗 4 ℃孵育过夜，回

                1.2.3  细胞培养                                       收抗体，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，二抗室温下孵
                    HEK ⁃ 293T 和 ESCC 细 胞（包 括 KYSE ⁃ 70 和         育 1 h，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，孵育 ECL 发光

                KYSE⁃410 细胞）分别使用含有 10%胎牛血清（fetal                  液，通过化学成像仪检测目标蛋白表达情况，采集
                bovine serum，FBS）和1%青霉素⁃链霉素的DMEM和                 图像。利用 Image J 分析获取相关条带灰度值用于
                RPMI⁃1640 培养基培养（包装病毒时不加双抗），培                      统计分析。
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