Page 30 - 南京医科大学自然版
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第45卷第7期
               ·928 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年7月


              1.2.8 凝集素免疫共沉淀（lectin⁃immunoprecipitation，
                                                                2 结     果
              Lectin⁃IP）
                  收集细胞裂解液，加热蛋白变性后，超声处理                          2.1  ST3GAL3在ESCC组织中的表达情况
              裂解细胞，离心吸取上清液 100 μL，作为 Input，放                         首先在 GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.
              入-20 ℃冰箱备用，将剩余上清液加入MAM琼脂糖                         gov/geo/）的不同数据集中分析比较了 ST3GAL3 在
              珠中，在4 ℃轮转孵育2 h，4 ℃离心弃上清，RIPA裂                     ESCC 组织及其癌旁正常组织中的 mRNA 表达情
              解液洗琼脂糖珠 3 遍后进行样品处理，最后 WB 检                        况。分析结果显示，在 23 对 ESCC 组织和其相应癌
              测目的蛋白表达情况。                                        旁正常组织的 GSE130078 数据集中，ST3GAL3 的

              1.2.9  细胞增殖实验                                     mRNA 在肿瘤组织中高表达（图 1A）。此外，在
                  将稳转细胞接种到预先包被好细胞外基质                            GSE111011 和 GSE119436 数据集中，也得出类似结
             （extracellular matrix，ECM）的 12 孔板中，每组细胞            果（P均<0.01，图1B、C）。
              每个时间点4个复孔，每天用胰酶消化细胞后，通过                                进一步检测21对新鲜ESCC组织及癌旁正常组
              台盼蓝染色结合血细胞计数板计数细胞数目，持续                            织中 ST3GAL3 的表达情况，qRT⁃PCR 结果显示，
              计数4 d，处理数据，绘制细胞增殖曲线。                              ST3GAL3 基因在肿瘤组织中的表达水平明显高

              1.2.10  细胞迁移实验                                    于癌旁正常组织（P < 0.001，图 2A）。此外，97 例
                  使用 24 孔 Transwell 小室检测分析相关细胞的                 ESCC组织石蜡切片的IHC分析表明，ST3GAL3蛋白在
              迁移能力。提前使用ECM包被Transwell小室，在无                      肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织（图2B）。
              菌上室中加入100 μL细胞悬液（含1万个细胞），在                        以上结果表明，ST3GAL3 在 ESCC 组织中的 mRNA
              下室中加入 500 μL 含有 5%FBS 培养基，孵育培养                    和蛋白表达均显著上调。
              12~24 h，用镊子小心取出小室，PBS 清洗 2 遍，用                    2.2  ST3GAL3表达与临床病理资料的关系
              4% PFA 室温固定 15 min ，PBS 清洗 2 遍，结晶紫室                    为探讨ESCC患者组织中ST3GAL3表达的临床
              温染色15~30 min，PBS清洗4遍，显微镜观察染色情                     意义，根据上述 IHC 结果中 ST3GAL3 的表达情况，
              况，拍照获取3个随机视野照片，统计分析实验结果。                          将 ESCC 患者组织样本分为两组，即高表达组（IRS
              1.2.11  细胞铺展实验                                    免疫反应评分>3 分）和低表达组（IRS 免疫反应评
                  配制 1%BSA/DMEM 及黏附分析专用培养基                      分≤3分），对比分析ST3GAL3高表达组和低表达组
             （0.1% BSA+50 mmol/L HEPES/DMEM）。事先用1 mL            患者的生存预后情况。Kaplan⁃Meier 生存曲线显
              ECM/PBS（10 μg/mL）4 ℃包被6 cm培养皿过夜，PBS               示，ST3GAL3 高表达组的 ESCC 患者总生存率比低
              清洗1遍，加入1% BSA于37 ℃培养箱封闭1 h，PBS                    表达组明显降低（P = 0.002，图2C）。
              清洗 1 遍，每皿加 1.5 mL 黏附分析培养基置于培养                          此外，进一步分析 ST3GAL3 表达与临床病理
              箱预热备用。将细胞重悬于黏附分析培养基中置                             资料的相关性，发现其表达与患者的 TNM 分期
              于培养箱孵育45 min（每15 min轻弹1次）。将细胞                    （P=0.004）、肿瘤侵犯程度（T分型，P <0.001）以及淋
              悬液加到相应培养皿中，轻轻摇匀后培养箱中孵育                            巴结转移（N分型，P=0.017）呈明显正相关，与年龄、
              15 min。轻轻吸弃培养基，PBS轻洗1遍，4% PFA固                    性别、吸烟史、分化程度、肿瘤大小无关（P > 0.05，
              定10 min后，PBS再次轻洗1遍，显微镜拍照后统计                       表 2）。同时，多因素 COX 比例风险回归模型统计
              分析。                                               结果显示，ST3GAL3 的表达（P=0.022）和 TNM 分期

              1.3  统计学方法                                       （P=0.008）是ESCC患者预后的独立危险因素（表3）。
                  采用 GraphPad Prism10 和 SPSS26 软件分析数            2.3  ST3GAL3 表达对 ESCC 细胞增殖、迁移能力的
              据。定量数据表示为均数±标准差（x ± s），通过                         影响
              t 检验或 ANOVA 检验进行分析。采用卡方检验                              为检测 ST3GAL3 对 ESCC 细胞生物学行为的
              分析 ST3GAL3 与临床病理特征的相关性。采用                         影响，首先利用 CCLE 数据库检测 ST3GAL3 在不同
              Kaplan⁃Meier 生存曲线结合 Log⁃rank 检验评估生存               ESCC 细胞株中的 mRNA 表达情况（图 3A），选择
              率。运用 Cox 比例风险回归模型探讨影响食管癌                          ST3GAL3 表 达 相 对 较 低 的 KYSE⁃410 细 胞 构 建
              患者生存的危险因素。P < 0.05 为差异有统计学                        ST3GAL3 野生型（wild type，WT）以及酶活突变型
              意义。                                              （Mutant，A320P and D370Y）过 表 达 稳 转 细 胞 系
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