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第45卷第7期
               ·938 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2025年7月


              孔板上划 1 道划痕。0、24、48 h 后记录划痕处细胞                     侵袭性的肝癌细胞中表达较高，如 SUN⁃423、Huh⁃7
              迁移情况。                                             等，提示CNN2参与肝癌的侵袭转移（图1C、D）。
              1.2.5  Transwell迁移实验                              2.2  CNN2与肝癌预后相关
                  将细胞用300 μL培养液稀释置于上室，另外将                            根 据 癌 症 基 因 组 图 谱（The Cancer Genome
              含有 20%FBS 的完全培养液置于下室。在细胞培                         Atlas，TCGA）数据库中的肝癌数据分析，CNN2在肝
              养箱中培养 48 h 后，用 10%福尔马林固定 30 min，                  癌组织中表达增加（P < 0.001，图2A）。对本中心肝
              用棉签擦去上室中的细胞，并用 0.1% 结晶紫染色                         癌组织芯片免疫组化染色结果的进一步分析也提
              30 min。在显微镜下随机拍下 3 个视野，并计算染                       示，CNN2在肝癌组织中高表达，在癌旁组织中低表
              色细胞面积占比。                                          达（P < 0.001），且 CNN2 的高表达和肝癌患者的总

              1.2.6  Western blot                               生存率呈负相关（P=0.004），CNN2 高表达的患者预
                  提取细胞总蛋白，用 10% SDS⁃PAGE 进行蛋白                   后较差（图2B~D）。
              分离，并转移到 PVDF 膜上，用 5%脱脂奶粉溶液封                       2.3  CNN2促进肝癌侵袭和转移
              闭 1 h，加入相应一抗溶液 4℃孵育过夜。次日使用                             为了研究CNN2表达与肝癌细胞侵袭转移的相
              PBST 洗涤膜 3 次，室温孵育二抗 1 h，PBST 清洗膜                  关性，实验通过LV⁃CNN2 shRNA在Huh⁃7细胞中敲
              3次，最后对膜进行曝光成像，Image J软件定量分析。                      低CNN2的基因表达（图3A）。随后在划痕实验中，

              1.2.7  免疫荧光染色                                     发现 CNN2 低表达显著抑制肝癌细胞的迁移能力
                  将细胞接种并培养至50%~70%汇合，用PBS冲                     （P < 0.01，图3B）；同样在迁移实验中，CNN2低表达
              洗后加入4%多聚甲醛固定液，室温孵育10~15 min。                      的肝癌细胞通过 Transwell 小室的细胞数目显著减
              使用0.1% Triton X⁃100透化液孵育10 min，再用PBS              少（P < 0.01，图 3C）。在肝癌组织病理切片的免疫
              洗涤。加入 1%~5% BSA 封闭液，室温孵育 1 h。加                    组化染色和划痕实验的免疫荧光染色中发现，CNN2
              入稀释的一抗，4 ℃孵育过夜或室温孵育 1~2 h，然                       在肝癌组织的肿瘤边缘区域表达增加（图3D、E），进
              后洗涤细胞并加入荧光标记的二抗，室温孵育 1 h。                         一步表明CNN2参与调控肝癌细胞的群体性迁移。
              再次洗涤后，染色细胞核并用封片液封片。最后，                            2.4  ECM力学信号调控CNN2促进肝癌细胞迁移
              使用荧光显微镜观察并拍摄图像进行分析。                                    ECM的生物力学特性，特别是其压力和张力对
              1.2.8  硬质培养基实验                                    肿瘤细胞迁移产生重要影响              ［13］ 。本研究通过使用
                  为模拟致密细胞外基质环境，评估肿瘤细胞在                          硬质培养基模拟体内ECM的硬度条件，发现在硬质
              刚性基质中的迁移能力，将细胞接种于含有0.6%琼                          培养基中培养的肝癌细胞中，CNN2 蛋白的表达量
              脂的培养基中，并置于预先铺有2%琼脂的底层中，                           明显高于普通培养条件下的细胞（P < 0.01，图4A），
              形成双层结构。细胞于 37 ℃孵育 10~14 d，期间每                     敲低 CNN2 后肝癌细胞的迁移能力显著降低（P <
              2~3 d补加培养基，随后观察细胞生长状态，观察并                         0.001，图4B），提示CNN2在感知ECM力学信号并促
              拍摄细胞在琼脂中的生长状态，评估其聚集、伸展                            进肝癌细胞迁移方面发挥重要作用。
              或迁移的能力。                                           2.5  CNN2影响肝癌细胞群体性迁移受Wnt/PCP信
              1.3  统计学方法                                        号调控
                  所有实验数据分析均采用 SPSS 22.0 和 Graph⁃                     通 过 LV ⁃ Wnt11 shRNA 敲 低 Huh ⁃ 7 细 胞 中
              Pad Prism 9 进行。组间比较采用 Student’s t 检验，             Wnt11 的表达（图 5A），发现 CNN2 的表达水平下降
              应用 Kaplan⁃Meier 法进行生存分析，组间差异比较                   （P < 0.01，图 5B），肝癌细胞的迁移能力显著降低；
              采用Log⁃rank检验，P < 0.05为差异有统计学意义。                   同时敲低 CNN2 的情况下，肝癌细胞的迁移能力进

                                                                一步降低（P < 0.01，图 5C），表明 CNN2 参与 Wnt/
              2 结    果
                                                                PCP信号通路调控肝癌细胞迁移。
              2.1  CNN2在肝癌细胞中高表达
                                                                3 讨     论
                  经人类蛋白图谱（Human Protein Atlas，HPA）数
              据库（https//www.proteinatlas.org）分析显示，与其他                细胞群体性迁移是肿瘤转移的主要机制，其中
              人体正常组织相比，肝脏中 CNN2 mRNA 表达水平                       分子信号通路和 ECM 力学信号的协同调控起着关
              较低（图 1A、B）。通过数据分析发现 CNN2 在具有                      键作用。CNN2 作为细胞骨架的重要组成部分，通
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