Page 39 - 南京医科大学自然版
P. 39

第45卷第7期         陶子凡，刘一纬，吴晓峰，等. Wnt/PCP通路和细胞外基质力学信号共同调控CNN2促进肝癌
                  2025年7月              细胞群体性迁移［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（7）：936-944                   ·937 ·


                PCP signaling pathway regulates the expression and function of CNN2，while CNN2，as a mediator of mechanical signals，is regulated
                by ECM mechanical signals. Together，they synergistically drive the collective migration of HCC cells.
               ［Key words］ hepatocellular carcinoma；calponin 2；collective migration；Wnt/PCP signaling pathway；mechanical signaling
                                                                              ［J Nanjing Med Univ，2025，45（07）：936⁃944］




                    肝癌具有高度侵袭性和转移性，这些特征显著                          抗体（Abcam公司，美国）。
                影响患者预后 。因此，深入研究肝癌的侵袭与转                            1.2  方法
                            ［1］
                移机制，对开发有效的靶向治疗策略具有重要的临                            1.2.1  人组织标本及微阵列
                床意义。近年研究揭示，肿瘤的转移实际上是由一                                组 织 微 阵 列 芯 片（tissue microarray，TMA）由
                群紧密连接的肿瘤细胞协同向邻近组织迁移，即群                            224 个肝癌样本及其相应的邻近非癌组织组成，样
                体性迁移，而非单个细胞独立迁移               ［2-4］ 。这一过程不        本由南京医科大学第一附属医院肝胆中心收集。
                仅体现细胞间的相互作用，也反映肿瘤细胞在迁移                            所有患者于 2009 年 1 月—2010 年 12 月接受肝癌根
                过程中整体性的行为模式。在肝癌的进展过程中，                            治性手术。自 2016 年起，每 3 个月对患者进行 1 次
                肝纤维化被认为是推动肿瘤侵袭和转移的一个关                             随访，直至 2019 年 10 月 25 日或患者死亡。所有研
                键因素。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的              究程序均已获得南京医科大学伦理委员会批准（伦
                                                           ［5］
                重塑和变化在这一过程中扮演至关重要的角色 。                            理批号：2021⁃SREA⁃287）。CNN2 的染色评分结合
                特别是在纤维化状态下，ECM的物理和生物力学特                           细胞染色强度和免疫反应细胞的百分比评估，采用
                性显著改变，从而影响肝癌细胞的迁移和侵袭能                             免 疫 反 应 评 分（immunoreactivity score，IRS）法 。
                力。细胞群体性迁移的动力学过程，实际上是由                             CNN2免疫染色强度评分为0~3分（0分，阴性；1分，
                ECM重塑所引发的力学信号调控的，这一过程受到                           弱；2 分，中等；3 分，强）；免疫反应细胞的百分比评
                ECM 的生物力学特性，尤其是其压力、张力和刚度                          分为 1 分（0~25%）、2 分（>25%~50%）、3 分（>50%~
                      ［6］
                的影响 。                                             75%）和 4 分（>75%~100%）。由两名病理医生独立
                    钙调蛋白2（calponin 2，CNN2）是一种肌动蛋白                 对每个微阵列组织点进行评分，并将平均评分作为
                结合蛋白，主要定位于应力纤维末端及细胞膜的外                            最终评分。根据IRS评分，CNN2的表达水平分为低
                周突起区域，作为细胞力学感受因子，有助于细胞                            表达（IRS：0~4分）和高表达（IRS：6~12分）。
                感知与响应外部的机械应力 。研究表明，CNN2在                          1.2.2  细胞培养
                                         ［7］
                多种恶性肿瘤中呈异常高表达               ［8-11］ ，并参与调控细            肝癌细胞株 Huh⁃7 使用含有 10%FBS 的 DMEM
                胞形态维持、迁移能力及收缩功能等关键生物学                             培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生
                过程，在肿瘤细胞的侵袭与转移中发挥着重要作                             长期的细胞进行后续实验。
                用 ［12］ 。然而，关于 CNN2 与肝癌中 ECM 之间相互作                 1.2.3  慢病毒感染
                用及其具体调控机制的研究仍相对缺乏。本研究                                 敲低CNN2和Wnt11的shRNA慢病毒载体（LV⁃
                旨在探讨CNN2在肝癌细胞群体性迁移过程中的功                           CNN2⁃shRNA、LV⁃Wnt11⁃shRNA）由上海科斯瑞生
                能及其潜在分子机制，为肝癌的侵袭转移研究及靶                            物科技有限公司合成并包装。将 Huh⁃7 细胞以 2×
                向干预策略提供新的理论依据和研究思路。                               10 个/孔的密度接种于 6 孔板，培养至细胞密度达
                                                                    5
                                                                  50%~70%时，按照推荐的剂量加入慢病毒液。感染
                1 材料和方法
                                                                  后继续培养48 h，随后用PBS冲洗细胞，并更换为新
                1.1  材料                                           鲜完全培养液。感染48 h后，使用10 μg/mL嘌呤霉
                    人源肝癌细胞Huh⁃7由本实验室保存。DMEM                       素对细胞进行筛选，期间每2~3 d更换1次筛选培养
                高糖培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、               液，持续 5~7 d，直至未感染对照组细胞完全死亡。
                0.25%胰蛋白酶（Gibco 公司，美国）；引物由南京金                     筛选后的细胞用于后续实验。
                斯瑞公司合成；DEPC处理水、PMSF、RIPA蛋白裂解                      1.2.4 划痕实验
                液（上海碧云天公司）；Transwell 小室（康宁公司，美                        将细胞接种在 6 孔板中，用不含 FBS 的培养液
                国）；CNN2 抗体、Wnt11 抗体、GAPDH 抗体、Tublin               培养 24 h。然后用 200 μL 的移液枪头尖端在每个
   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44