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第45卷第8期 刁庆飞，张        昊，杨春白雪，等. EZH2靶向FAK/F⁃actin/ROS信号通路影响结直肠癌进展的机制研究［J］.
                  2025年8月                     南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（8）：1110-1122                      ·1113 ·


                1.2  方法                                           于裸鼠左侧腋下。自接种当日起每天观察裸鼠状
                1.2.1  细胞培养                                       态及肿瘤生长情况。裸鼠一般状况良好，在接种后
                    SW480 细胞和 SW620 细胞在含有 10% FBS 和               14 d观察到注射部位皮下有直径2~3 mm的肿瘤，表
                1%青霉素⁃链霉素的 DMEM 培养基中培养，置入                         示接种成功     ［22］ 。每天观察裸鼠状态、死亡情况及肿
                37 ℃、5% CO2的加湿培养箱中，每 24 h 更换 1 次培                 瘤生长情况，测量皮下移植瘤的最大长径（a）和横径
                养基。待细胞密度>70%时，用0.25%胰蛋白酶进行                       （b），计算移植瘤的体积。
                传代。下述实验均采用第3代细胞进行实验。                              1.2.5  Western blot检测

                1.2.2  免疫组化检测                                         用含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液从 SW480
                    收集人体结直肠癌组织和癌旁标本组织，先经                          细胞中提取总蛋白，然后用BCA蛋白定量试剂盒进
                10%福尔马林溶液固定 48 h，然后依次进行组织脱                        行蛋白定量。使用 10% SDS⁃PAGE 对蛋白质进行
                水、透明、浸蜡处理，将蜡块切成 6 μm 厚的切片，置                       分离，将分离的蛋白质转移到 PVDF 膜上，用 5%脱
                于 65 ℃烤箱中烤片 1 h。接着二甲苯脱蜡 15 min，                   脂牛奶封闭后，用稀释的一抗EZH2抗体（1∶1 000）、
                乙醇梯度性脱水（100%乙醇浸泡 10 min，95%乙醇                     p⁃FAK 抗体（1∶1 000）、p⁃Paxillin 抗体（1∶1 000）、

                浸泡 10 min，80%乙醇浸泡 10 min），然后用 1×PBS               NOX2抗体（1∶5 000）、NOX4抗体（1∶1 000）、RUNX3
                缓冲液冲洗 10 min，一共冲洗 3 次，采用离心机，                      抗体（1∶1 000）、p⁃JNK 抗体（1∶1 000）和 GAPDH 抗
                100 r/min 10 ℃，离心 10 min。后加入 3% H2O2室温            体（1∶1 000）分别 4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤 3 次，加
                孵育10 min，然后1×PBS缓冲液冲洗后甩干水分，加                      入相应二抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次。使用ECL
                入5%山羊血清（山羊血清+PBS），37 ℃封闭15 min。                   系统检测蛋白表达，Image J 软件进行灰度值分析，
                进行一抗二抗孵育及DAB溶液显色，将切片置于显                           计算蛋白的表达量。
                微镜下观察染色合适即可停止染色，清水冲洗5 min。                        1.2.6  免疫荧光染色
                进行苏木精复染，自来水冲洗5 min，1%盐酸酒精分                            SW480 细胞培养 24 h，PBS 洗涤 3 次后，室温下
                化3 s，自来水冲洗5 min，脱水透明后滴加适量中性                       4%多聚甲醛中固定15 min，然后使用0.5% TritonX⁃
                树胶封片。使用 Image J 软件对免疫组化图像进行                       100通透15 min。加入提前配制好的鬼笔环肽染色
                鉴定和分析，并计算结直肠癌和癌旁标本组织的阳                            工作液，室温孵育 30 min 后，PBS 清洗 3 次，用 DAPI
                性率。评价标准：深棕色为强阳性，棕黄色为中度                            溶液复染细胞核，滴加抗荧光淬灭封片剂封片，置
                阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。                              于激光共聚焦显微镜下观察并分析荧光图像。
                1.2.3  慢病毒感染                                      1.2.7  细胞划痕实验
                    慢病毒颗粒使用 Lenti⁃X HT 包装系统制备。                        将 SW480 细胞和 SW620 细胞接种于 96 孔板
                             5                                    上，待细胞密度达 90%时，使用无菌枪头在细胞层
                将细胞以4×10 个/孔的数量接种于添加了 10% FBS
                的DMEM的6孔板中。培养24 h后，细胞汇合度约为                        上划痕，PBS 清洗 3 次后，去除划下的细胞，加入无
                50%~70%，将培养基换成900 μL无血清DMEM。慢                     血清培养基，置于 37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，
                病毒在 Opti⁃MEM 中连续稀释，以获得 10~100 的不                  在 0、48 h 置于显微镜下观察并拍照，划痕宽度用
                同 MOI。每孔加入总共 100 μL 稀释的慢病毒并培                      Image J软件计算。
                养24 h，更换培养基并培养72 h，含嘌呤霉素的培养                       1.2.8  Transwell实验
                基用于选择转导细胞。EZH2 mimic组使用EZH2过                          细胞饥饿12 h后，将各组转染后的SW480细胞
                表达慢病毒感染SW480细胞与SW620细胞。                           和 SW620 细胞以 5×10 个/孔加入含有 200 μL 无血
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                    将 SW480、SW620 细胞分为 4 组：EZH2 NC 组，             清培养基的 Transwell 小室中，下室加入 600 μL 含
                EZH2 mimic组，EZH2 NC+细胞松弛素D（0.1 μg/mL）             10%胎牛血清的 DMEM 培养基，37 ℃孵育 48 h 后，
                组，EZH2 mimic+细胞松弛素D（0.1 μg/mL）组。                  用棉签去除上室内残留的细胞，膜下表面细胞用

                1.2.4  裸鼠模型建立及分组                                  2%结晶紫染色。在显微镜下取 5 个不同视野进行
                    将 24 只 6~8 周龄健康裸鼠随机分成 EZH2 NC                 拍照，并计数膜下表面的细胞数量，取平均值。
                组、EZH2 mimic 组、EZH2 NC+细胞松弛素 D 组和                 1.2.9 CCK⁃8实验
                EZH2 mimic+细胞松弛素D组，每组各6只。取转染                          将 SW480 细胞和 SW620 细胞以 2×10 个/孔的
                                                                                                        3
                3 代后的 SW480 细胞 150 μL（含 1×10 个细胞）接种               浓度培养于96孔板中，并置于培养箱中培养。在0、
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