Page 55 - 《南京医科大学学报》2026年第1期

第46卷第1期 郁心怡，戴 艳，史梦琦，等. 多聚胞嘧啶结合蛋白2在大别班达病毒感染中的作用及
2026年1月 机制［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（1）：47-54，67 · 49 ·

5% CO2的培养箱中培养过夜。弃去培养基后，用 内参β⁃Actin，稀释度均为 1∶1 000）4 ℃过夜，用
PBS 洗涤细胞 3 次。然后加入 DBV 稀释溶液，并在 TBST洗膜3次后加入二抗HRP标记的山羊抗免IgG
37 ℃、5% CO2条件下孵育 12 h。接着，将 Iron Assay （1∶5 000）溶液，室温孵育1 h，TBST充分洗涤3次后
工作溶液（浓度为 1 μmol/L）添加至细胞中，并在 使用天能5200化学发光凝胶成像系统成像。
培养箱中孵育 30 min，最后用荧光显微镜观察细胞 1.2.6 免疫荧光检测
的荧光信号。 THP⁃1 细胞经 DBV 感染 12 h 并加入铁死亡抑
1.2.3 ROS测定 制剂或诱导剂处理后，依次进行以下操作：样本首
将THP⁃1细胞以2×10 个∕孔的密度接种于24孔 先用PBS漂洗，随后经4%多聚甲醛室温固定30 min
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板中培养 24 h，随后用 PBS 轻柔洗涤细胞 2 次以防 及 0.1% Triton X⁃100 室温透化 10 min；接着以 0.5%
培养基残留，加入 20 μmol/L 的 2，7⁃二氯荧光素二 BSA 封闭 30 min，之后先后与按 1∶1 000 稀释的抗
乙酸酯（2，7⁃dicholrofluorescein diacetate，DCFH⁃DA） DBV 核蛋白（nuclear protein，NP）一抗（4 ℃过夜）及
探针工作液，置于 37 ℃培养箱中避光孵育30 min， 按1∶5 000稀释的相应荧光二抗（室温避光1 h）进行
再次用PBS洗涤2次以去除未进入细胞的探针。通 孵育；最后经 DAPI 染核 10 min，封片后在荧光显微
过荧光显微镜初步观察荧光产物二氯荧光素的分布 镜下观察并采集图像。
情况，随后使用微孔板读数仪在488 nm激发波长和 1.2.7 稳转株构建
525 nm发射波长条件下定量测定荧光强度。 慢病毒载体LV3⁃pGLV3/H1/GFP⁃Puro由上海吉

1.2.4 半数组织培养感染剂量（50% tissue culture 玛基因股份有限公司合成，PCBP2 过表达和敲低的
infective dose，TCID50）的测定 具体序列见表1。将靶向PCBP2的质粒或shRNA序
按照 DBV 核酸检测试剂盒说明书进行操作。 列克隆至慢病毒载体，随后转染 THP⁃1 细胞，使用
首先使用试剂盒提供的定量标准品建立标准曲线， RPMI 1640 培养基培养。通过 10 μg/mL 嘌呤霉素
依次进行结合、洗涤和洗脱步骤。将裂解产物转移 筛选获得稳定转染细胞系，PCBP2 的表达水平经
至核酸结合柱，12 000 g离心1 min使核酸特异性结 qRT⁃PCR和Western blot验证。
合到硅胶膜上。使用500 μL 洗脱液洗脱杂质，随后 1.2.8 RNA提取与qRT⁃PCR分析
用 35 μL 预热的洗脱液获得高纯度病毒 RNA。在 先在细胞样本中加入裂解液，然后一起转移至
ABI 7500 实时 PCR 仪上运行程序：50 ℃ 15 min； RNA 吸附柱，离心后弃废液，随后洗涤3次彻底去除
95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s→55 ℃ 45 s（收集荧光），45个 杂质，空管离心2 min去除残留乙醇后加入适量无核
循环。 酸酶水，室温静置2 min，最后离心洗脱获得RNA。
1.2.5 Western blot检测 采用 PrimeScript RT Master Mix 进行逆转录，
收集THP⁃1细胞后，添加200 μL的细胞裂解混 42 ℃反应15 min，85 ℃灭活5 min获得cDNA。定量
合液（加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）在冰上提 PCR采用TB Green Premix Ex Taq，在ABI QuantStudio 5
取蛋白，采用 BCA 法测定蛋白浓度。加入 Loading 荧光定量系统上完成。以 GAPDH 作为内参基因，
buffer高温变性，进行10% SDS⁃PAGE凝胶电泳分离 采用2 -ΔΔCT 法计算基因相对表达量，所有实验均重复
并转印至 PVDF 膜，5%脱脂奶粉溶液室温下封闭 3 次。PCR 引物由上海生工生物有限公司合成，具
2 h。加入配好的一抗（SLC7A11、GPX4、PCBP2 及 体序列见表1。

表1 引物序列与慢病毒shRNA序列
Table 1 The sequences of primers and lentivirus shRNA
Primer Sequence（5′→3′）
Homo⁃PCBP2⁃F ATTATCACTTTGGCTGGACC
Homo⁃PCBP2⁃R GATGGATTGTGGAATGCC
Homo⁃GAPDH⁃F ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
Homo⁃GAPDH⁃R GCCATCACGCCACAGTTTC
OE
Homo⁃PCBP2 ⁃F CGCGGATCCGCCGCCACCATGGCCGAGGCGGCGGCG
OE
Homo⁃PCBP2 ⁃R CCGGAATTCTCAGTCCGGGTCCTCCAGGT
Homo⁃PCBP2 -/- GAATTGTCCTGAGAGAATTAT