Page 22 - 南京医科大学自然版
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第46卷第10期
·1452 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2026年10月
0.2 mL/10 g体重的剂量腹腔注射三溴乙醇工作液进 450 nm波长处吸光度。
行麻醉。以足底退缩反射消失作为麻醉深度足够 1.2.8 蛋白质提取与Western blot分析
的标志，随后采用颈椎脱臼法处死小鼠，于无菌条 弃去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次；每孔加
件下采集卵巢。 入 150 μL 含 1%蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的
1.2.3 免疫荧光染色 RIPA 裂解液，冰上裂解 30 min，用细胞刮匙收集裂
卵巢组织经 4%多聚甲醛固定后，常规石蜡包 解液。裂解液转移至1.5 mL离心管，4 ℃、12 000 g离
埋、切片。切片经脱蜡、水化、抗原修复及封闭后， 心15 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度：按50∶1混
以 PRDX4 一抗孵育，随后用相应荧光二抗标记， 合BCA试剂A与B，取1 μL蛋白样品加入200 μL工
DAPI 复染细胞核。封片后于共聚焦显微镜下观察 作液，37 ℃孵育30 min，测定562 nm吸光度，根据标
PRDX4在卵巢GC中的定位。 准曲线计算浓度。
1.2.4 细胞培养 取 30~50 μg 蛋白，加入 5×上样缓冲液，100 ℃
KGN 细胞培养于含 10%胎牛血清、1%青霉素⁃ 煮沸 10 min。经 SDS⁃PAGE 分离后，采用湿转法
链霉素⁃新霉素的DMEM/F⁃12培养基中，置于37 ℃、 （200 mA，适当时间）将蛋白转移至 PVDF 膜。快速
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5% CO2培养箱内。将KGN细胞以每孔1.2×10 个/mL 封闭液室温封闭 30 min，加入一抗（P16、P21、P53、
的密度接种于 6 孔板（每孔体积 1 mL），培养至细胞 GAPDH、Lamin B1，按说明书稀释），4 ℃孵育过夜。
融合度为80%~90%时，进行后续实验处理。 次日，TBST洗膜3次，每次10 min；加入HRP标记二
1.2.5 KGN细胞的鉴定 抗，室温孵育 2 h。TBST 洗膜后，ECL 化学发光显
为确认细胞纯度，以卵泡刺激素受体（follicle 色，Tanon 6100 成像系统采集图像。Image J 分析条
stimulating hormone receptor，FSHR）作为 GC 的特异 带灰度值，以目的蛋白与GAPDH 、Lamin B1灰度比
性标志物，进行免疫荧光染色。具体操作步骤如 值进行半定量分析。
下：将 KGN 细胞接种于预置细胞爬片的培养板中， 1.2.9 RNA 提取与实时荧光定量 PCR（quantitative
待细胞贴壁后，PBS洗涤。加入4%多聚甲醛室温固 real time PCR，RT⁃qPCR）
定 20 min，0.5% Triton X⁃100 室温通透 20 min，免疫 采用 TRIzol 法提取细胞总 RNA，测定浓度与纯
荧光封闭液室温封闭 30 min。弃去封闭液，加入 度后，使用 HI Script Ⅲ RT Super Mix 逆转录试剂盒
FSHR 一抗，4 ℃孵育过夜；PBS 洗涤后，加入 Alexa 将RNA逆转录为cDNA。引物序列见表1。
Fluor 594 标记的二抗，室温避光孵育 1 h；PBS 洗涤
表1 引物序列
后，以含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂封片。最后于
Table 1 Primer sequences
荧光显微镜下采集图像，观察FSHR阳性细胞比例，
Gene Primer sequence（5′→3′）
以评估细胞纯度。
IL⁃1α F：AATCATCAAGCCTAGGTCAGC
1.2.6 KGN衰老模型的建立
R：CTTCATCTTGGGCAGTCACA
待细胞融合度达 80%左右时，加入不同浓度 IL⁃1β F：GTTGAAAGATGATAAGCCCACT
（0、50、125、250、500 nmol/L）的Tg，分别处理不同时 R：GTTATATCCTGGCCGCCTT
间（12、24、48、72 h）。通过CCK⁃8法检测细胞活力， IL⁃6 F：CACACAGACAGCCACTCACC
并检测衰老相关蛋白（P16、P21、P53）及衰老相关分 R：ATTTTCACCAGGCAAGTCTCC
泌表型（senescence⁃associated secretory phenotype， IL⁃8 F：CAGTTTTGCCAAGGAGTGCTA
R：TTTTCCTTGGGGTCCAGACA
SASP）因子［白介素（interleukin，IL） ⁃1α、IL⁃1β、IL⁃6、
GAPDH F：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
IL⁃8］的表达变化，综合筛选出能够稳定诱导细胞衰
R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
老且细胞活力下降不显著的较优条件。
1.2.7 细胞活力检测 qPCR 反应体系（20 μL）：2 × ChamQ Universal
将对数生长期的 KGN 细胞接种至 96 孔板，每 SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）
孔 2 000~5 000 个细胞；细胞贴壁过夜后，加入不同 各0.4 μL，模板cDNA 2.0 μL，DEPC水7.2 μL。每个
浓度的Tg处理不同时间，然后检测细胞活力。处理 样本设 4 个复孔，于 Quant Studio 3 荧光定量 PCR 仪
结束后，每孔加入 10 μL CCK⁃8 工作液，37 ℃孵育 上运行。反应程序：95 ℃预变性 30 s；95 ℃ 5 s、
30 min~4 h（根据显色情况调整），用酶标仪测定 60 ℃ 20 s，共 40 个循环；熔解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃
