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第46卷第10期             刘怡珂，李超凡，宋海燕，等. 鞣花酸靶向miR⁃18a/TSP⁃1轴减轻缺血性脑损伤［J］.
                 2026年10月                    南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（10）：1479-1491                     ·1481 ·


                恩科生物合成。                                           1.2.8  Transwell实验
                1.2  方法                                               收集干预后的RBMEC，用无血清培养基重悬为
                                                                      4
                1.2.1  细胞培养                                       5×10 个/mL密度。将200 μL细胞悬液加入上室，下
                    RBMEC采用含15%胎牛血清、1%青霉素及1%                      室加入600 μL含10%胎牛血清的完全培养基作为趋
                链霉素的 DMEM 培养基，置于 37 ℃、5% CO2、95%                  化剂。37 ℃孵育24 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，
                饱和湿度的恒温培养箱中培养。细胞传代培养至                             0.1%结晶紫染色 20 min，PBS 漂洗。在倒置显微镜
                对数生长期后用于后续实验。                                     下拍摄5个随机视野的迁移细胞并进行计数。
                1.2.2  CCK⁃8检测RBMEC细胞活力                           1.2.9  管形成实验
                    将 RBMEC 接种于 96 孔板，孵育 24 h 后更换为                    实验前 1 d，将基质胶置于冰盒中，4 ℃过夜缓
                含不同浓度 EA 的完全培养液，每个浓度设 5 个复                        慢解冻。解冻后，用培养基按 1∶1 比例稀释基质胶
                孔。继续培养24 h后加入CCK⁃8试剂避光孵育2 h，                      制备工作液。将50 μL工作液加入12孔板各孔中，
                酶标仪在 450 nm波长下测定各孔吸光度，计算相对                        于37 ℃孵育促进聚合和凝固。将经过OGD 并给予
                于对照组的细胞活力。                                        不同浓度 EA 处理的 RBMEC 接种于铺有基质胶的

                1.2.3  OGD模型的建立与EA干预                              板上。培养 24 h 后，观察管状网络结构的形成情
                    将 RBMEC 接种于培养板，培养至细胞融合度                       况。使用倒置显微镜捕获图像，并利用Image J软件
                60%~70%，更换为无糖 DMEM 培养基，置于三气培                      量化分支节点数。

                养箱（95% N2、5% CO2，37 ℃）中培养8 h以模拟OGD                1.2.10  透射电镜观察
                损伤。随后更换为正常培养基，分别给予不同浓度                                按标准程序制备样品用于透射电镜观察：细胞
                EA干预 24 h。                                        用2.5%戊二醛和1%锇酸固定，梯度乙醇脱水，环氧
                1.2.4  TUNEL染色                                    树脂包埋。制备超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅进行
                    制备细胞爬片，PBS缓冲液清洗3次后，4%多聚                       双重染色，在透射电镜下观察线粒体超微结构。
                甲醛室温固定 20 min；随后采用 0.4% Triton X⁃100              1.2.11  MCAO动物模型的建立
                室温通透处理 10 min。按照 TUNEL 检测试剂盒说                         大鼠适应性饲养 1 周［温度（24±2）℃、湿度
                明书配制 TdT 酶反应液，于 37 ℃避光孵育 60 min，                  60%］，自由饮食饮水。1周后，将动物随机分为3组
                使荧光标记 dUTP 掺入 DNA 断裂末端。PBS 洗涤                    （每组6只）：①假手术组；②MCAO 组；③EA+MCAO
                后，使用抗荧光淬灭封片剂封片。倒置荧光显微镜                            组。EA+MCAO 组参考已发表的方案               ［19］ ，于 MCAO
                下观察并采集图像。                                         术前 10 d 起每日予以 50 mg/kg EA（溶解于 0.5%羧
                1.2.5  流式细胞术（flow cytometry，FCM）                  甲基纤维素钠的生理盐水溶液中，终浓度5 mg/mL）
                                                             4    灌胃，持续 10 d；假手术组和 MCAO 组给予等体积
                    收集干预后的细胞，用PBS漂洗并重悬为5×10
                个/mL，随后加入 Annexin V 和碘化丙啶（propidium               羧甲基纤维素钠生理盐水混悬液。第 11 天参照既
                iodide，PI）染色，室温避光孵育 15 min，使用流式细                  往研究描述的方法进行MCAO 手术，采用盲法在术
                胞仪进行分析。                                           后第1、3、7、10天使用Longa评分法评估神经功能缺
                1.2.6 蛋白质印迹（Western blot，WB）                      损 ［20］ 。Longa评分1~3分判定为模型建立成功，并纳
                    用 RIPA 裂解液提取细胞或脑组织总蛋白，经                       入后续实验分析。于 MCAO 术后第 10 天完成神经
                SDS⁃PAGE 分离，转印至 PVDF 膜上，一抗 4 ℃孵育                  功能评分后，对大鼠进行麻醉并处死，迅速取脑。
                过夜。HRP标记的二抗孵育后，使用ECL检测系统                          MCAO组及EA+MCAO组分离缺血侧大脑皮质及纹
                显影条带。                                             状体周围的缺血半暗带组织，假手术组采集相应解

                1.2.7  EdU实验                                      剖部位的脑组织。根据后续实验用途对采集的脑
                    将细胞与 20 μmol/L EdU 工作液在 37 ℃孵育                组织进行分割。部分组织置于 4%多聚甲醛中固
                2 h，移除培养基用4%多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤                        定，用于后续HE染色及TUNEL染色；其余组织经液
                后以0.5% Triton X⁃100通透细胞，加入Click反应混                氮快速冷冻后保存于-80 ℃，分别用于总 RNA 和总
                合物，避光孵育 30 min，用 Hoechst33342 染细胞核，               蛋白提取及后续分子生物学检测。其中，从 MCAO
                洗涤后在荧光显微镜下观察并计算 EdU 阳性细胞                          组和EA+MCAO 组分别随机选取3只大鼠的缺血半
                比例。                                               暗带脑组织进行miRNA微阵列分析，每只大鼠作为
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