Page 52 - 南京医科大学自然版
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第46卷第10期
               ·1482 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年10月


              1 个独立生物学重复，样本间不进行混合。其余相                           psiCHECK⁃2 载体中。使用 Lipofectamine 3000 共转
              关组织样本按照相应实验要求用于WB检测。实验                            染 miR⁃18a mimic 或阴性对照，转染48 h后，按试剂
              操作经巴彦淖尔市医院伦理委员会批准（批件号：                            盒说明依次测定萤火虫与海肾荧光素酶活性，以海
              BSYY⁃2021019）。                                    肾/萤火虫荧光素酶活性比值校正转染效率，并将转
              1.2.12  苏木精⁃伊红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色            染WT质粒与阴性对照组的相对荧光素酶活性归一
                  脑组织在4%多聚甲醛中固定24 h，经梯度乙醇                       化为1.0，计算各实验组的相对活性。
              脱水，石蜡包埋，切成 5 μm 厚切片。切片经二甲苯                        1.3  统计学方法
              脱蜡、梯度乙醇复水后，依次进行苏木精染色、盐酸                                所有统计分析均使用 GraphPad Prism8 软件进
              乙醇分化、流水返蓝和伊红复染，在光学显微镜下                            行。数据以均值±标准差（x ± s）表示。两组间比较
              观察形态结构。                                           采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析（one⁃

              1.2.13  miRNA微阵列分析                                way ANOVA），事后检验采用 Tukey 法。P < 0.05 为
                  用TRIzol提取1.2.11干预后大鼠脑组织缺血半                    差异有统计学意义。
              暗带总 RNA，Agilent 2100 生物分析仪确认 RNA 完
                                                                2 结     果
              整性。按说明书完成 Agilent 大鼠 miRNA 微阵列的

              miRNA 表达谱分析。原始数据使用 GeneSpring GX                  2.1  EA减轻OGD诱导的RBMEC损伤
              软件进行标准化和分析。差异表达筛选标准为：变                                 CCK⁃8实验表明，在非缺氧条件下，≤50 μmol/L
              化倍数（fold change，FC）>2.0或FC<0.5，且P < 0.05。         的 EA 干预 24 h 对 RBMEC 未显示出明显的细胞毒
              1.2.14  生物信息学预测                                   性（图1A）。25 μmol/L 和50 μmol/L EA 处理的细胞
                  利用 miRWalk、TargetScan 和 StarBase 三大在线         活力较高，因此用于后续试验。
              数据库，独立预测miR⁃18a⁃5p在大鼠中的潜在靶基                            TUNEL 染色结果显示，与 Control 组相比，OGD
              因。对大鼠 miR⁃18a 序列进行检索。随后，借助                        组TUNEL阳性细胞显著增加（P < 0.01），而EA干预
              Metascape 平台对候选基因进行基因本体论（gene                     组 TUNEL 阳性细胞较 OGD 组显著减少，其效应呈
              ontology，GO）富集分析。                                 剂量依赖性（图 1B、C）。FCM 同样证实，与 OGD 组
              1.2.15  核酸转染                                      相比，EA 干预可剂量依赖性地降低细胞凋亡率
                  将对数生长期的RBMEC以 1×10 个/孔的密度接                   （P < 0.01，图1D、E）；提示EA可降低OGD诱导的细
                                               5
              种于6孔板中，将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培                      胞凋亡率。WB进一步证实，EA能逆转OGD引起的
              养至融合度达到 70%~80%。将 5 μL Lipofectamine              凋亡相关蛋白表达失衡，上调Bcl⁃2并下调Bax的表
              3000试剂与100 pmol miR⁃18a antagomir或阴性对照            达（P < 0.05，图1F、H）。
             （NC组）分别稀释于125 μL Opti⁃MEM 无血清培养                    2.2  EA 恢复了 OGD 损伤的 RBMEC 血管新生功能
                                                TM
              基中，轻柔混匀。随后将两份稀释液混合（总体积                            并保护线粒体超微结构
              250 μL），室温静置孵育15~20 min。随后，逐滴加入                        EdU 实验显示，与 Control 组相比，OGD 组 EdU
              已更换为新鲜无血清培养基的细胞中，轻摇混匀。                            阳性细胞显著减少（P < 0.01），而 EA 干预后 EdU 阳
              于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育6 h后，更换为完全培                     性细胞较OGD组增多（图2A、B）。WB分析显示，与
              养基继续培养18 h，随后按1.2.3中方法进行OGD造                      Control 组相比，OGD 组PCNA 与Cyclin D1表达显著
              模与EA干预实验。                                         下调（P < 0.01）；而EA干预后二者表达较OGD组显

              1.2.16  实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative                著上调（图 2C~E）。Transwell 与管形成实验表明，
              real⁃time polymerase chain reaction，qRT⁃PCR）      与 OGD 组相比，EA 干预组细胞迁移数量以及成管

                  用 TRIzol 从 RBMEC 中提取总 RNA，按 Prime⁃            数量显著增多（P < 0.05），且效应呈浓度依赖性
              Script RT 试剂盒说明反转录为 cDNA，以 miScript              （图 2F~I），提示 EA 能逆转 OGD 损伤后细胞的迁移
              SYBR Green PCR试剂盒定量miR⁃18a表达，以U6作                 能力并促进成管。

              为内参。使用2       -ΔΔCt 法计算mRNA相对表达量。                      此外，透射电子显微镜观察发现，OGD 可导
              1.2.17 双荧光素酶报告基因实验                                致 RBMEC 线粒体出现明显肿胀、嵴结构模糊等

                  将包含预测结合位点的大鼠Thbs1基因3′⁃UTR                     超微结构损伤，而 EA 干预后微结构损伤明显减轻
              野生型（WT）或种子序列突变型（MUT）片段克隆至                        （图 2J）。
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