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第46卷第10期             王新新，黄伯贤，陆嘉逢. PUS7通过mRNA假尿嘧啶化调控胚胎发育过程中神经
                 2026年10月             谱系分化平衡［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（10）：1437-1449                 ·1439 ·


                PUS7既可能通过tRNA⁃翻译轴发挥作用，也可能通                        bit IgG H&L（合肥 Biosharp 公司）、Goat Anti⁃Mouse
                过 mRNA/pre⁃mRNA 上的Ψ修饰直接调控神经相关                     IgG H&L（武汉 Abclonal 公司）、Donkey Anti⁃Rabbit
                转录本命运。                                            IgG（H + L）Highly Cross ⁃ Adsorbed Secondary Anti⁃
                    尽管已有证据支持 PUS7 与神经系统异常相                        body、Alexa Fluor 488（Invitrogen公司，美国）。
                                                                                 TM
                关，但 PUS7 在早期神经谱系分化中的作用机制以                         1.2  方法
                及mRNA Ψ化在其中的作用尚不清楚。由于体内胚                          1.2.1 mESC培养与形态学观察
                胎发育过程复杂，难以直接解析细胞自主性作用，本                               野生型（wild type，WT）mESC和Pus7 基因敲除

                研究采用小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem                 （Pus7⁃knockout，Pus7⁃KO）mESC 均在含 2i/LIF 的
                cell，mESC）体外拟胚体自发分化与神经外胚层定向                       N2B27 体系中，于 37 ℃、5% CO2 培养箱内维持培

                分化体系，结合亚硫酸盐诱导缺失测序（bisulfite⁃                      养。细胞密度达到约80%时使用温和消化液传代，
                induced deletion sequencing，BID⁃seq）和转录组测序        并确保两组在相同起始密度和相近传代数下进行
               （RNA sequencing，RNA⁃seq）联合分析，系统评估Pus7              后续实验。于倒置显微镜下观察克隆边界、细胞大
                缺失对神经谱系分化的影响，并探讨其与mRNA Ψ化                         小及整体克隆形态，并拍摄代表性图像。通过这些
                调控之间的关系。                                          指标评估Pus7缺失是否导致明显的基础状态异常。
                                                                  1.2.2 细胞转染
                1  材料和方法
                                                                      采用 Lonza 电转体系进行 CRISPR/Cas9 相关质
                1.1 材料                                            粒转染。每次取约1.0×10 个细胞，加入Cas9质粒和
                                                                                         6
                    本研究所使用的细胞系为 mESC（中国科学院                        双单导向 RNA（single guide RNA，sgRNA）载体，按
                动物研究所），相关细胞实验均按照实验室生物安                            照电转仪说明书程序完成电转。转染后恢复培养，
                全和细胞培养规范开展。                                       通过基因型PCR筛选阳性克隆。
                    细胞培养相关试剂：高糖培养基（Dulbecco’s                     1.2.3 Pus7基因敲除mESC构建
                modified eagle medium，DMEM）、DMEM/F12培养基、              采用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 Pus7⁃KO
                Neurobasal 培养基、N2 添加剂、B27 添加剂（Gibco 公             mESC 模型。在 Pus7 基因第 2 和第 3 外显子区域设
                司，美国）；CHIR99021、PD325901（Selleck 公司，美             计 2 条 sgRNA，其 靶 向 序 列 分 别 为 5′ ⁃ GCGCAG⁃
                国）；白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，            GAAGTGACGTCTCC⁃ 3′和 5′⁃CACC⁃TGACTTTTT⁃
                LIF）（Sigma 公司，美国）；基质胶 Matrigel（Corning 公          CACCTCA⁃3′，诱导目标区域300 bp片段切除，导致
                司，美国）以及全反式维甲酸（retinoic acid，RA）                   编码序列发生移码突变，从而造成Pus7基因功能丧
               （MCE 公司，美国）。RNA 提取与检测相关试剂：                         失。将 Cas9 及 sgRNA 相关质粒通过电转方式导入
                TRIzol 试剂（TaKaRa 公司，日本）、HiScript Ⅲ qRT            WT mESC后，使用嘌呤霉素筛选3 d，以富集转染阳
                SuperMix 反 转 录 试 剂 盒 、2 × ChamQ SYBR qPCR         性细胞。药筛结束后继续培养，待细胞状态稳定并
                Green Master Mix（南京Vazyme公司）。细胞周期检测               达到合适密度后，通过流式分选获得单细胞克隆。
                相关试剂：核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）与              随后对候选单克隆细胞进行扩增培养，提取基因组
                碘化丙啶（propidium iodide，PI）（上海Sangon公司）。            DNA并进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳初步鉴
                    转 录 组 文 库 构 建 使 用 VAHTS Universal V10         定基因型，并进一步采用测序确认目标片段缺失情
                RNA⁃seq Library Prep Kit for Illumina（南京 Vazyme   况。WT mESC 作为对照。用于基因敲除的 sgRNA
                公司）。免疫检测相关抗体：PUS7、SRY⁃box 转录因                     序列及基因型鉴定引物序列见表1。

                子 1（SRY⁃box transcription factor 1，SOX1）（上海Ab⁃    1.2.4 Western blot实验
                cam 公司）；SOX2、NANOG 同源盒蛋白（NANOG ho⁃                    RIPA 裂解液提取蛋白质。BCA 法定量后加入
                meobox，NANOG）抗体、Kruppel 样因子 4（Krüppel⁃            上样缓冲液，于98 ℃变性10 min。蛋白样品经SDS⁃
                like factor 4，KLF4）、配对盒基因 6（paired box 6，         PAGE 分离后，转移至 PVDF 膜，5%脱脂奶粉溶液

                PAX6）、八聚体结合转录因子 4（octamer⁃binding                 封闭 1 h，加入一抗 4 ℃孵育过夜，再加 HRP 标记
                transcription factor 4，OCT4）、甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶          二抗（1∶5 000）室温孵育 1 h，ECL 化学发光液显色
               （glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase，GAPDH）   并 采 集 图 像 。 检 测 蛋 白 主 要 包 括 PUS7、OCT4、
               （武汉 Proteintech 公司）。二抗包括：Goat Anti⁃Rab⁃            SOX2、NANOG、KLF4 和 PAX6（1∶2 000），以 Tubu⁃
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