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第46卷第10期             王新新，黄伯贤，陆嘉逢. PUS7通过mRNA假尿嘧啶化调控胚胎发育过程中神经
                 2026年10月             谱系分化平衡［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（10）：1437-1449                 ·1441 ·


                             表2 qRT⁃PCR引物序列                       因素的实验使用two⁃way ANOVA，并用Šídák’s multi⁃
                       Table 2 Sequence of qRT⁃PCR primers        ple comparisons test 进行组间多重比较。P < 0.05为差

                  Gene      Primer sequence（5′→3′）
                                                                  异有统计学意义。
                 Nanog      Forward：TCTTCCTGGTCCCCACAGTTT
                            Reverse：GCAAGAATAGTTCTCGGGATGAA       2  结 果
                 Oct4       Forward：CGGAAGAGAAAGCGAACTAGC
                                                                  2.1  Pus7敲除mESC模型的构建与验证
                            Reverse：ATTGGCGATGTGAGTGATCTG
                                                                      为明确PUS7在mESC命运调控中的作用，本研
                 Klf4       Forward：GTGCCCCGACTAACCGTTG
                                                                  究首先采用CRISPR/Cas9技术敲除Pus7基因第2和
                            Reverse：GTCGTTGAACTCCTCGGTCT
                 Sox2       Forward：GCGGAGTGGAAACTTTTGTCC         第 3 号外显子并引入后续移码，建立 Pus7 敲除
                            Reverse：CGGGAAGCGTGTACTTATCCTT        mESC模型（图1A）。基因组PCR及琼脂糖凝胶电泳
                 Sox1       Forward：AGACAGCGTGCCTTTGATTT          结果显示，KO 细胞出现与预期大小一致的特异性
                            Reverse：TGGGATAAGACCTGGGTGAG          条带，而WT细胞保留完整扩增片段，测序结果显示
                 Pax6       Forward：TACCAGTGTCTACCAGCCAAT
                                                                  目标区域 300 bp 已被成功切除。该结果从基因组
                            Reverse：TGCACGAGTATGAGGAGGTCT
                                                                  水平初步证明了Pus7敲除细胞系构建成功。
                 Bmp4       Forward：TTCCTGGTAACCGAATGCTGA
                                                                      在此基础上，进一步从RNA和蛋白两个层面验证
                            Reverse：CCTGAATCTCGGCGACTTTTT
                 Kdr        Forward：TTTGGCAAATACAACCCTTCAGA       Pus7的敲除效果。qRT⁃PCR检测结果显示，Pus7⁃KO
                            Reverse：GCAGAAGATACTGTCACCACC         细胞中 Pus7 mRNA 表达完全缺失（图 1B）；Western
                 Sox17      Forward：GATGCGGGATACGCCAGTG           blot 结果同样证实 KO 组 PUS7 蛋白表达缺失（图
                            Reverse：CCACCACCTCGCCTTTCAC           1C）；免疫荧光染色结果也显示KO细胞内未检测到
                 Gata4      Forward：CCCTACCCAGCCTACATGG           PUS7阳性信号（图1D）。这些结果均表明，Pus7⁃KO
                            Reverse：ACATATCGAGATTGGGGTGTCT        细胞中 PUS7 表达的完全缺失，已成功构建稳定可
                 Ncam1      Forward：GACAGAACCCGAAAAGGGC
                                                                  靠的Pus7敲除mESC模型。
                            Reverse：GTTGGGGACCGTCTTGACTT
                                                                  2.2  Pus7 敲除未显著破坏 mESC 核心多能性网络，
                 Map2       Forward：GCCAGCCTCAGAACAAACAG
                                                                  但导致G1期延长
                            Reverse：AAGGTCTTGGGAGGGAAGAAC
                                                                      在 2i/LIF 维持条件下，WT 与 Pus7⁃KO mESC 均
                 Aldh1l1    Forward：CAGGAGGTTTACTGCCAGCTA
                                                                  可形成边界较清晰、排列相对致密的胚胎干细胞样
                            Reverse：CACGTTGAGTTCTGCACCCA
                 Nrxn3      Forward：TGGGCTGCCTTAAAGAGGTTG         克隆（图2A），表明Pus7缺失未明显破坏mESC的典
                            Reverse：GGGGTCTCAAAGTTGATGGGA         型克隆形态。为进一步评价多能性状态，检测了
                 Adam23     Forward：CGTCCTTCTCCTGCTACCTG          Oct4、Sox2、Nanog 和 Klf4 核心多能性因子的表达。

                            Reverse：TGATAGGGGCTTTCTGAGTCC         根据 qRT⁃PCR 结果，KO 组 Oct4、Nanog 和 Klf4 转录
                 Plxnd1     Forward：GAGCAAGCGCAACATACAGC
                                                                  水平与 WT 组相比未见显著下降，但 Sox2 mRNA 略
                            Reverse：GGCTACAGTCAGCACTCGC
                                                                  有下降（图 2B）。在 Western blot 结果中，多能性核
                 Slc1a1     Forward：CTTCCTACGGAATCACTGGCT
                                                                  心因子蛋白总体维持稳定：SOX2、NANOG、KLF4在
                            Reverse：CGATCAGCGGCAAAATGACC
                                                                  两组间无显著差异，OCT4 蛋白出现一定程度上调
                 Ulk4       Forward：TAACTGGGATATACGGTCCAAGG
                                                                 （图 2C、D）。因此，尽管 Pus7敲除可引起部分多能
                            Reverse：TGTGATCGCCTCGATAACAGG
                 Ahi1       Forward：AAGCAGTCGCTCAGTAAGGG          性因子在 RNA 或蛋白层面的轻微波动，但整体上
                            Reverse：CTCGGTCCTCCACGTTTTGAT         mESC 的多能性状态仍可在 2i/LIF 条件下维持，未
                                                                  见明显多能性受损表型。以上结果表明，Pus7敲除不

                1.3  统计学方法                                        直接破坏mESC的核心干性网络，其后续产生的表型
                    实验数据采用GraphPad Prism 10、FlowJo及R语             更可能来源于基础细胞状态改变以及命运转换能力
                言相关软件进行分析。定量数据表示为均数±标准差                           异常，而非由多能性受损所致。

               （x ± s）。单一时间点两组间比较使用双侧非配对Stu⁃                          尽管多能性未受到显著影响，但 Pus7⁃KO 细胞
                dent’s t检验；同一实验中多个基因的两组间比较使                       在培养过程中表现出生长减慢的特征，克隆体积较
                用多重独立样本 t检验，并进行FDR校正。涉及两个                         WT 偏小（图 2A）。CCK⁃8 检测结果显示，两组细胞
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