Page 12 - 南京医科大学自然版

第46卷第10期
·1442 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2026年10月

A B 1.5
WT Pus7⁃KO ***
mRNA level 1.0
Cas9
1 000 bp 0.5
596 bp
gRNA 500 bp Pus7
250 bp 232 bp
Pus7 Ex.2⁃3 0
WT Pus7⁃KO
ttcttttcatcagatactctgactttgtc /⁃⁃⁃⁃⁃⁃/ttgccatcgaggtaagcggcgcag original seq.
ttcttttcatcag⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃/⁃⁃⁃⁃⁃⁃/⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃⁃gtaagcggcgcag del 300 bp
C D Hoechst PUS7 Merge
WT Pus7⁃KO Pus7⁃KO Pus7⁃KO
WT
WT
PUS7 60 kDa
WT
GAPDH
36 kDa

Pus7⁃KO

50 μm

A：Schematic diagram showing the generation of the Pus7⁃KO mESC line. B：qRT⁃PCR analysis of Pus7 mRNA levels in WT and Pus7⁃KO mESC，
***
P < 0.001（n=3）. C：Western blot analysis of PUS7 protein levels in WT and Pus7⁃KO mESC（n=3）. D：Immunofluorescence analysis of PUS7 expres⁃
sion in WT and Pus7⁃KO mESC（n=3）；Hoechst was used for nuclear staining（blue），and PUS7 was shown in green. Scale bar=50 μm.
图1 Pus7敲除mESC系的构建及验证
Figure 1 Generation and validation of Pus7 knockout in mESC

在接种后6 h时吸光度无明显差异；但在24 h和48 h 转录组逐步重塑的规律；同时，在同一时间点内WT
时，KO 组细胞活力明显低于 WT 组（图 2E），表明 与 KO 样本也呈现可区分趋势，且这种分离在 d0 阶
Pus7 敲除并未影响初始贴壁与早期存活状态而是 段已开始出现，表明Pus7敲除的影响在分化程序启
抑制了mESC增殖。进一步通过流式细胞仪分析了 动前就已存在（图 3C）。进一步比较三胚层相关标
细胞周期变化。与 WT 组相比，Pus7⁃KO 细胞 G1 期 记基因发现，KO 组外胚层相关基因整体呈上调趋
比例升高，S 期比例下降，而 G2/M 期比例变化不明 势，其中 Sox1、Pax6 等经典外胚层和神经外胚层标
显（图 3F、G），已知 mESC 通常具有较短 G1 期和较 志变化尤为明显（图3D）。
快的增殖速度 ［22- 24］ ，因此本研究中 Pus7 敲除后 随后，对外胚层、中胚层和内胚层代表基因进
mESC的基础细胞状态已发生改变。 行了qRT⁃PCR验证。结果显示，KO组Sox1、Pax6外
2.3 Pus7敲除促进EB分化过程中外胚层谱系倾向 胚层标记基因显著升高（图3E），表明Pus7敲除主要
为评估 Pus7 敲除对 mESC 后续谱系分化的影 伴随外胚层相关分化程序的增强。
响，本研究首先建立EB自发分化模型（图3A），从三 2.4 Pus7 敲除促进早期神经祖细胞程序增强并伴
胚层形成角度观察其效应。在相同起始接种条件 随后续成熟相关程序受阻
下，KO 来源的 EB 球体在分化过程中呈现一定形态 在EB模型中观察到Pus7缺失导致外胚层分化
学差异，主要表现为球体相对偏小、边缘较不规则， 增强，尤其是神经外胚层相关基因Sox1和Pax6表达
周围可见更多碎屑（图3B）。这些形态学观察提示， 异常升高，基于上述发现，本研究进一步采用RA诱导
Pus7敲除可能影响EB形成过程中的细胞聚集状态 的体外神经谱系定向分化体系（图4A），探究Pus7敲
及形态均一性。 除在神经谱系分化过程中的影响。在诱导过程中，

为系统分析EB分化阶段的分子变化，在 d0、d3 WT细胞逐渐形成相对有序的神经上皮样结构，并出
和d5阶段进行RNA⁃seq检测。PCA分析显示，样本 现更明显的细胞延展和突起趋势；相比之下，KO组形
首先沿时间轴发生明显分离，符合 EB 分化过程中 成大面积致密的神经上皮样细胞结构，细胞排列更