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第46卷第10期
·1440 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2026年10月
表1 敲除细胞株鉴定所用引物序列
Table 1 Primer sequences used for identification of knockout cell lines
Name Primer sequence（5′→3′）
Pus7 identification primer Forward：AGTATAGAAGTGCATGTGCTCCA
Reverse：AGTCACCCTTTAGTTAAGCACAGA
Gapdh Forward：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG
Reverse：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lin、GAPDH（1∶5 000）作为内参。 以分析三胚层和多能性相关基因的表达动态。
1.2.5 RNA提取 1.2.10 神经祖细胞定向分化
细胞经TRIzol裂解后进行氯仿抽提和异丙醇沉 Matrigel 预包被培养板，室温放置 1 h，接种
淀，75%乙醇洗涤 RNA 沉淀后，用无 RNA 酶水溶 mESC 后以 N2B27 神经诱导培养基培养，并于诱导
解。采用 NanoDrop 检测 RNA 浓度和纯度，合格样 第2天加入RA启动神经外胚层定向分化。RA储备
品分装放置于-80 ℃保存，用于后续qPCR和测序。 液 浓 度 为 10 mmol/L，每 孔 取 2 μL 储 备 液 加 入
1.2.6 荧光定量PCR N2B27培养基中，使培养体系终体积为2 mL，RA 终
使用 TRIzol 试剂提取总 RNA，测定 RNA 浓度。 浓度为10 μmol/L。分别在 d0、d3和d5收集样本，用
取 1 μg 总 RNA，使用 HiScript Ⅲ Q RT SuperMix 试 于形态观察、RNA/蛋白检测和流式分析。
剂盒逆转录为cDNA。采用SYBR Green体系进行实 1.2.11 细胞免疫荧光与流式分析
时荧光定量 PCR，Gapdh 作为内参。引物覆盖多能 将细胞接种于包被的培养板中，4%多聚甲醛固
性相关基因（Oct4、Sox2、Nanog、Klf4）、三胚层相关 定后以 0.1% Triton X⁃100 通透，使用含 BSA 和正常
基因（Sox1、Pax6、Bmp4、Kdr、Sox17、Gata4）、神经分 血清的封闭液封闭后加入 SOX1 一抗（1∶200），4 ℃
化相关基因（Sox1、Pax6、Map2、Ncam1、Aldh1l1）及 孵育过夜。次日洗涤后加入荧光二抗（1∶1 000），
候选神经连接基因（Nrxn3、Adam23、Plxnd1、Slc1a1、 DAPI 或 Hoechst（1∶1 000）复染细胞核并封片，在荧
Ulk4、Ahi1）。每个样本设置技术重复，使用 2 -ΔΔCt 法 光显微镜下采集图像。为定量分析SOX1阳性细胞
计算相对表达量，并在至少 3 次独立生物学重复基 比例，分化细胞消化为单细胞悬液后按类似流程进
础上进行统计分析。引物序列见表2。 行胞内染色，使用流式细胞仪检测信号，FlowJo软件
1.2.7 CCK⁃8检测 统计SOX1阳性率。
以每孔 2 000 个细胞的密度接种于 96 孔板，分 1.2.12 RNA⁃seq建库和BID⁃seq建库
别在接种后 6、24、48 h 加入 CCK⁃8 工作液，37 ℃孵 用TRIzol法提取总RNA，用于RNA⁃seq 和BID⁃
育 30 min 后于 450 nm 处读取吸光度。根据吸光度 seq的建库。RNA⁃seq 文库使用商业试剂盒 VAHTS
变化评估不同时间点的细胞活力和增殖趋势。 Universal V10 RNA⁃seq Library Prep Kit for Illumina，
1.2.8 细胞周期检测 按说明书完成构建，并在 Illumina 平台进行双端测
细胞接种于 6 孔板后，于指定时间点收集并以 序。BID⁃seq 文库参照文献报道的 BID 建库方法完
70%乙醇固定。固定细胞经 FACS buffer 清洗后， 成 ［21］ ，重点用于检测神经诱导阶段Ψ修饰差异。生
加入含 RNase A 和 PI 的染色液，在 37 ℃避光孵育 物信息学分析包括质量控制、比对、表达量矩阵构建、
30 min。样本上机后选择PE通道收集PI荧光信号， 差异分析、PCA及GO富集等。使用 DESeq2 包进行
并利用FlowJo软件拟合细胞周期分布，统计G1、S和 RNA⁃seq 差异表达分析，差异基因筛选用 Benjamini⁃
G2/M期比例。 Hochberg 方法进行校正，判定标准为 P < 0.05 且
1.2.9 拟胚体（embryoid body，EB）形成 |log2 fold change（FC）|≥1。BID⁃seq 使用 limma 进行
采用悬滴法建立 EB 分化体系。将单细胞悬液 差异假尿嘧啶修饰化分析，并用 Benjamini⁃Hoch⁃
调整至2 000个/25 μL，滴加于培养皿盖上形成悬滴； berg 方法对多重检验结果进行 FDR 校正，差异Ψ化
第2天将形成的EB转入低吸附培养板继续培养，并 基因位点筛选标准为假发现率（false discovery rate，
分别在 d0、d3和d5进行形态观察与样本收集。使用 FDR）<0.05 且 |log2 FC|≥1。后续使用 clusterProfiler
明场显微镜记录 EB 大小、边缘紧密程度及碎屑情 包进行 GO 富集分析，富集结果用 Benjamini⁃Hoch⁃
况。收集样本用于RNA提取、qRT⁃PCR和RNA⁃seq， berg 校正，显著性判断标准为P < 0.05。
