Page 61 - 《南京医科大学学报》自然科学版2026年第2期

第46卷第2期 沈链链，管强东，丁竞竞，等. 微孔板成像系统在高表达荧光蛋白单克隆细胞株筛选中的应用［J］.
2026年2月 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（2）：213-220 ·217 ·

Stably transfected cells Monoclonal cell strain 1 Monoclonal cell strain 2 Monoclonal cell strain 3
250 250 250 250
（×10 3 ） 200 15.7% （×10 3 ） 200 99.8% （×10 3 ） 200 97.7% （×10 3 ） 200 99.4%
GFP+
GFP+
GFP+
GFP+
150
150
150
150
SSC⁃A 100 SSC⁃A 100 SSC⁃A 100 SSC⁃A 100
50 50 50 50
0 0 0 0
0 10 3 10 4 10 5 0 10 3 10 4 10 5 0 10 3 10 4 10 5 0 10 3 10 4 10 5
GFP⁃A GFP⁃A GFP⁃A GFP⁃A
图6 流式细胞术检测稳定转染细胞和单克隆细胞的GFP
Figure 6 Flow cytometric analysis of GFP in stably transfected cells and monoclonal cells

Stably
transfected
cells

Monoclonal
cells

图7 稳定转染细胞与单克隆细胞的荧光和明场成像
Figure 7 Fluorescence and bright⁃field imaging of stably transfected cells and monoclonal cells

经单细胞分选后入孔的多为荧光较强的细胞，荧光 定的压力 ，且喷嘴尺寸越小，细胞所受压力越大；
［9］
较弱或无荧光细胞误入孔的概率较低，因此通常仅 ②目前广泛采用电荷式分选方式，包含细胞的液滴
凭荧光成像即可确认孔内细胞数。但以下情况下 需经历充电、偏转等步骤 ［19-20］ ，可能影响细胞状态；
需辅以明场观察：①孔内存在自发荧光杂质；②采 ③液滴高速撞击收集装置的液面可能导致细胞破
用非流式分选获得单细胞，需排除含弱荧光或无荧 裂 ［21］ 。因此，细胞在应激状态下可能出现自发荧
光细胞入孔的可能性。若明场成像仍难以区分细 光增强 ［22］ ，活性不高的细胞在分选过程中甚至直
胞或杂质，可于3~5 d后再次成像，通过观察其是否 接死亡 ［23］ ，而死细胞也可能产生自发荧光 ［24］ 。此
发生分裂进行判断，无分裂迹象的通常为杂质或失 外，单细胞制备过程中也不排除产生自发荧光的可
活细胞。在单克隆细胞株的筛选过程中，单细胞分 能 ［25］ 。因此，分选入孔后即刻测得的荧光强度并不
离后准确判断孔内是否为单细胞是一个关键难 能真实反映细胞稳定状态下的蛋白表达水平。
点。传统荧光显微镜观察不仅耗时耗力，且易出现 关于第1次消化传代时机，不宜过早进行，否则
误判。本研究采用 TECAN SPARK CYTO 微孔板成 细胞数量不足，消化传代过程易导致细胞损失甚至
像系统，实现了对整块96孔板的全孔快速成像，通过 全部丢失。本研究选择将第 1 次消化传代后（而非
荧光成像（必要时结合明场成像）精准判定细胞数量， 消化前）由软件分析获得的各孔细胞平均荧光强度
高效筛选出确为单细胞的孔，显著提高实验效率。 作为关键筛选指标，原因在于：为实现图像分析软
本研究未将单细胞分离当日的微孔板成像系 件对细胞的精确分割，细胞应以较低密度均匀铺
统分析的单细胞荧光强度作为筛选依据，主要基 板 ［26］ 。消化传代前细胞通常聚集成团，软件识别细
于以下原因：细胞分选入孔对细胞造成较大压力 胞误差较大，细胞平均荧光强度计算可信度低；而
与损伤，包括：①细胞在经历流式分选时需承受一 消化传代后细胞分散、间隔清晰，软件识别细胞准