Page 59 - 《南京医科大学学报》自然科学版2026年第2期

第46卷第2期 沈链链，管强东，丁竞竞，等. 微孔板成像系统在高表达荧光蛋白单克隆细胞株筛选中的应用［J］.
2026年2月 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（2）：213-220 ·215 ·

孔用于后续成像参数优化，其余95个孔均设置分选 胞株。上述过程细胞培养基均不含嘌呤霉素。
1个细胞入孔用于单克隆筛选。 1.2.5 单克隆细胞株的扩大培养与荧光强度验证
1.2.3 微孔板成像系统操作 继续培养筛选出的细胞株，通过数次消化传代
使用 TECAN SPARK CYTO 进行成像与分析。 将其转移至新的孔或更大的孔或培养皿中培养。自
①成像：使用“Fluorescence Imaging”功能进行荧光 分选后持续培养稳定转染细胞，培养条件与单克隆
和明场成像，4 倍物镜，全孔成像。预先使用 D7 孔 细胞一致（均不含嘌呤霉素）。待单克隆细胞增殖至
预览图像并优化成像参数。②图像查看：通过分析 细胞数足够时，对稳定转染细胞及单克隆细胞株，使
软件打开自动生成的实验文件，可点击查看任意孔 用BD LSRFortessa流式细胞仪进行GFP荧光强度检
的全孔荧光和明场成像。③数据分析：成像结束后 测；将等量细胞接种于96孔板，利用微孔板成像系统
系统自动完成初步分析，数据导出至 Excel 表格。 再次进行明场与荧光成像，直观比较荧光信号强弱。
必要时可调整参数后重新分析。
2 结 果
1.2.4 单克隆细胞株筛选流程
①筛选单细胞孔：单细胞分离当天，利用微孔 2.1 筛选单细胞孔
板成像系统的成像功能，观察荧光成像和明场成 分选完成后1~2 h，待细胞沉底后即用微孔板成
像，筛选出有且仅有 1 个细胞的孔。②筛选生成克 像系统成像，虽然分析软件能自动分析每孔内细胞
隆团的孔：待大多数能生成克隆团的孔已有较大的 数，但由于孔内可能有杂质，或者细胞形态稍有异常
克隆团（>20 个细胞）时，再次进行成像，筛选出具 等原因，导致有些孔的细胞数量分析不准确，因此并
有明显克隆团的孔。③细胞消化传代：将筛选出的 不建议直接采用细胞数量分析结果，而以肉眼观察荧
孔中的细胞分别消化、离心、重悬，并转移至新的 光成像、明场成像判读的细胞数为准。图1显示B4
96 孔板对应的孔中继续培养。④筛选细胞荧光强 孔的成像，单个细胞明场成像效果虽没有荧光成像那
度较强的孔：细胞转移至新孔（即上一个步骤）后，利 样一目了然，但仔细观察可见，细胞与杂质仍有较大
用微孔板成像系统成像，并获取各孔细胞的平均荧光 的区别，尚未贴壁的细胞圆且亮。从设定单细胞入
强度数据。将该数值从大到小排序，筛选出细胞平均 孔的95孔中筛选出89个有且仅有1个细胞的孔。
荧光强度数值较高的孔。⑤筛选细胞正常增殖的 2.2 筛选生成克隆团的孔
孔：待增殖最快的细胞增殖至第1次消化传代后数量 分选后 14 d，大多数能生成克隆团的孔已有较
的4~8倍时，再次成像。对比第1次消化传代后的成 大的克隆团（至少20个细胞），再次利用微孔板成像
像，以稳定转染细胞的增殖速度为参照，筛选出细胞 系统成像，从上述 89 孔中筛选出 19 个能生成克隆
增殖状态良好的孔，其中的细胞即为候选单克隆细 团的孔，图2显示B4孔的成像。

图1 含有单细胞的孔的荧光和明场成像
Figure 1 Fluorescence and bright⁃field imaging of a well containing a single cell

图2 含有克隆团的孔的荧光和明场成像
Figure 2 Fluorescence and bright⁃field imaging of a well containing a clonal cluster