Page 58 - 《南京医科大学学报》自然科学版2026年第2期

第46卷第2期
·214 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2026年2月

cell，19 wells with clonal clusters，6 wells with cells exhibiting higher mean fluorescence intensity，and 3 wells with normally
proliferating cells were successively identified. Flow cytometric analysis demonstrated that the monoclonal cell strains from these three
wells exhibited an approximately 9⁃fold increase in mean fluorescence intensity and a significant increase in the percentage of cells
exhibiting strong GFP fluorescence，compared to the stably transfected cells. This improvement was corroborated by microplate
imaging，which revealed markedly superior GFP fluorescence in the monoclonal cell strains. Conclusion：Using a microplate imaging
system in combination with the established screening protocol enables stepwise and efficient screening of monoclonal cell strains with
high fluorescent protein expression after stable transfection. Compared to traditional microscopy or other imaging methods，this
approach is simpler，more convenient，and holds significant potential for broader application.
［Key words］ monoclonal cell strain；fluorescent protein；microplate imaging system；screening
［J Nanjing Med Univ，2026，46（02）：213⁃220］

医学研究中，常使用荧光蛋白标记细胞，由于 隆细胞株。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）对细
1 材料和方法
［1］
胞基本无毒 ，近二十余年来被广泛使用 ［2-3］ 。然
而，外源基因整合至细胞基因组的效率存在差异， 1.1 材料
导致其在不同细胞中的表达水平不均 ，即便是稳 人支气管上皮细胞（human bronchial epithelial
［4］
定转染的细胞，随着培养时间延长，其整体表达水平 cell，HBE）（ATCC 公司，美国）；DMEM 培养基（赛默
也可能逐渐下降。解决该问题的最佳方法是在转染 飞世尔（苏州）仪器有限公司）；胎牛血清（上海达特
后分离单细胞并挑选最优的单克隆细胞株 ［5-7］ 。 希尔生物科技有限公司）；胰酶（上海碧云天生物技
稳定转染后挑选的理想单克隆细胞株应满足 术有限公司）；磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate buff⁃
以下条件：来源于单个细胞、增殖能力正常、平均荧 ered saline，PBS）（北京兰杰柯科技有限公司）；三抗
光强度高，且高表达荧光蛋白的细胞占比高（即均 （青霉素、链霉素、庆大霉素）混合溶液、嘌呤霉素
一性好）。对多数细胞类型而言，从单个细胞增殖 （北京索莱宝科技有限公司）；慢病毒（上海吉凯基
至足够流式细胞术检测的数量，通常需要至少 1 个 因医学科技股份有限公司）；黑壁透明底 96 孔板
月。在某些特殊情况下，为筛选最优细胞株甚至需 （Corning 公司，美国）；SPARK CYTO微孔板成像系统
使用多块 96 孔板。若依赖传统荧光显微镜观察并 （TECAN 公司，瑞士）；分选型流式细胞仪 FACSAria
记录每孔细胞的增殖情况与荧光强度，不仅耗时耗 Fusion 及 分 析 型 流 式 细 胞 仪 LSRFortessa（BD 公
力、易产生误差，且肉眼难以分辨较小的荧光强度 司，美国）。
差异，从而影响最优细胞株的筛选。 1.2 方法
目前市场上已有专门为单克隆成像与筛选这一 1.2.1 细胞培养与稳定转染细胞的构建
功能而设计的设备，如 CloneSelect Imager 细胞生长 HBE细胞采用DMEM 完全培养基（含10%胎牛
分析系统 ［8-9］ 、Cell Metric单克隆细胞追踪成像仪 和 血清、三抗）进行培养，培养环境为 37 ℃、5%CO2。
［10］
原位验证铺板（Verified In⁃situ Plate Seeding，VIPS）单 细胞贴壁后，取新鲜培养基并加入病毒、感染增强
克隆接种成像系统 ［11］ 等。然而，由于此类功能在一 试剂培养细胞，16 h 后更换为完全培养基，感染后
般科研项目中的使用频率有限，这类设备在高校中 72 h，用嘌呤霉素筛选构建稳定表达GFP的HBE细
尚不普及。相比之下，微孔板成像系统或具备类似 胞。筛选结束后使用不含嘌呤霉素的培养基培养。
［14］
功能的高内涵分析系统 ［12-13］ 、活细胞工作站 等，凭 1.2.2 稳定转染细胞的单细胞分离
借其高通量、多通道、全自动的图像采集与分析能力， 稳定转染细胞经流式细胞术进行单细胞分选，
广泛应用于细胞内物质代谢追踪及多靶点检测等领 简要流程如下：消化并收集处于对数生长期的细
域，已成为许多高校公共实验平台中的常规设备。 胞，用PBS重悬后，使用BD FACSAria Fusion 分选型
基于此，本研究建立了一套基于微孔板成像 流式细胞仪，设定单细胞分选模式，将高表达 GFP
系统的稳定转染后高表达荧光蛋白的单克隆细胞 的细胞分选至预先加入完全培养基（不含嘌呤霉
株筛选流程，并成功筛选出符合上述条件的单克 素）的96孔板中。其中，D7孔设置分选50个细胞入