Page 9 - 《南京医科大学学报》自然科学版2026年第2期
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第46卷第2期 方佳乐，邹        钰，李宪琦，等. hsa⁃miR⁃130a⁃3p在射血分数保留型心力衰竭诊断和预后中的应用研究［J］.
                  2026年2月                     南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（2）：163-172                        ·165 ·


                期；⑥严重肝或肾功能不全。非心衰对照组纳入标                            事件发生或随访截止日期之间的时间间隔。主要
                准：①年龄≥18 岁；②无 HF 的典型症状和（或）体                       复合终点事件定义为首次发生的主要心血管不良
                征；③NT⁃proBNP<125 pg/mL；④LVEF≥50%。排除               事件（major adverse cardiovascular events，MACE），包
                标准同 HFpEF 组。本研究已通过南京医科大学伦                         括心血管死亡及因心力衰竭再入院。心衰再入院
                理审查委员会的批准（批号：SR⁃2021⁃530），并知情                     定义为患者出院后因心力衰竭症状加重需要再次
                同意。                                               入院接受静脉药物治疗。对未发生事件或失访患
                    通过医院电子病历系统收集研究对象的临床                           者，以其最后一次随访时间进行删失处理。
                资料，包括年龄、性别、体重指数（body mass index，                  1.3  统计学方法
                BMI）等一般资料、既往病史、药物治疗情况，以及入                             所有数据采用 SPSS 27.0、R 4.5.0 及 Graphpad
                院后首次实验室检查指标和超声心动图参数等。                             Prism 10.0 软件进行统计分析与图形绘制。对于缺

                1.2  方法                                           失比例低于20%的变量，采用多重插补法进行数据
                1.2.1 样本的采集及总RNA的提取                               补全。连续变量的正态性采用Shapiro⁃Wilk 检验评
                    采集患者入院次日空腹血 2 mL，EDTA 抗凝，                     估。符合正态分布的连续变量以均数±标准差（x ±
                4 ℃条件下以 3 000 r/min 离心 10 min。离心后将上               s）表示，组间比较采用独立样本 t 检验；不符合正态

                清液转移至无 RNA 酶污染的离心管（RNA⁃Free EP                    分布的连续变量以中位数（四分位数）［M（P25，P75）］
                管），立即置于-80 ℃冰箱保存。总 RNA 提取使用                       表示，组间比较采用Mann⁃Whitney U检验。分类变
                FreeZol Reagent 试剂（南京 Vazyme 公司），操作步骤             量以例数和百分比［n（%）］表示，组间比较采用卡方
                参照试剂盒说明进行。RNA浓度与纯度通过Nano⁃                         或 Fisher 精确检验。采用受试者工作特征（receiver
                Drop 2000 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美        operating characteristic，ROC）曲线分析评估差异表
                国）检测，合格样本储存于-80 ℃以供后续分析。                          达 miRNA、可溶性生长刺激表达基因 2 蛋白（solu⁃
                1.2.2 miRNA测序及差异表达miRNA的筛选                        ble suppression of tumorigenicity 2，sST2）、H2FPEF 评
                    从发现队列中随机选取非心衰对照组 15 例、                        分及三者联合模型对HFpEF的诊断效能，并计算曲
                HFpEF 组30例血浆样本用于miRNA 测序分析。测                      线下面积（area under the curve，AUC）和95% CI。根
                序人群中HFpEF患者具有高龄、高血压及房颤等典                          据既往研究     ［14］ ，将H2FPEF 评分按≥6和<6分为两类
                型临床特征，其疾病表型与后续验证队列中HFpEF                         （分别代表HFpEF可能性高与低），将其作为分类变
                患者一致。将混合后血浆样本送至上海康成生物                             量纳入 ROC 分析。不同 ROC 曲线间的差异采用
                工程有限公司进行第二代高通量测序。测序数据                             DeLong检验比较。采用Kaplan⁃Meier法绘制生存曲
                经质量控制和标准化处理后，以|log2Fold Change|>                  线，比较不同miR⁃130a⁃3p表达水平组MACE的累积
                1.5且P < 0.05作为筛选标准，识别差异表达miRNA                    发生率，组间差异采用 Log⁃rank 检验。进一步通过
               （differentially expressed microRNA，DEM）。从获得        单因素及多因素 Cox 比例风险回归模型分析影响
                的差异表达谱中选取显著上调的10条miRNA 作为                         HFpEF患者预后的影响因素，结果以风险比（hazard
                候选标志物用于后续验证。                                      ratio，HR）及 95%CI 表示，计算方差膨胀因子（vari⁃
                1.2.3 RT⁃qPCR验证                                   ance inflation factor，VIF）以评估纳入多因素 Cox 回
                    候选 miRNA 引物由上海生工生物工程技术服                       归模型中各变量间的多重共线性。所有检验均为
                务有限公司设计合成，以 cel⁃miR⁃39 作为外源性对                     双侧检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
                照等量加至每份血浆与 miRNA 同步提取。逆转录
                                                                  2  结 果
                                  st
                反应采用 miRNA 1 Strand cDNA Synthesis Kit（by
                stem⁃loop）试剂盒（南京 Vazyme 公司），定量 PCR 使                  本研究共有 170 例符合 HFpEF 诊断的住院患
                用 SYBR qPCR Master Mix（南京 Vazyme 公司）在实            者，排除慢性阻塞性肺病急性加重患者1例、原发性
                时荧光定量 PCR 仪上检测。miRNA 的相对表达量                       肺动脉高压患者3例、自身免疫病患者4例、严重肾

                采用2  -ΔΔCT 法计算，所有样本均以3次重复取平均值                     功能不全患者2例、重度瓣膜病患者8例、恶性肿瘤
                以降低实验误差。                                          和严重贫血患者 4 例以及心肌病患者 15 例。最终
                    对所有入组的 HFpEF 患者在统一随访截止日                       纳入 133 例 HFpEF 患者以及同期住院的 53 例非心
                期前进行电话随访。随访时间定义为患者入院至                             衰对照组进入分析。
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