Page 70 - 《南京医科大学学报（自然科学版）》2026年第3期
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第46卷第3期
               ·378 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年3月


              去除上清液后取1 mL备用。接着，将NaOH与异丙                         为比较 rpoB 突变菌株对 RIF 和 RFB 的耐药水平，
              醇按照 1∶2 的比例混合制备处理液，并与 1 mL的                       将 MIC 进行对数转换（log2 MIC）后，采用配对样本
              备用液混合。将混合液放置于震荡器中震荡 30 s，                         Wilcoxon秩和检验分析其差异。所有假设检验均为
              随后取出并在室温下静置 15 min。将 2 mL 混合液                     双侧检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
              再次加入反应箱，最后在 Gene X⁃pert全自动检测仪
                                                                2  结 果
                                       ［15］
              器中检验，约 2 h后得出结果 。
              1.2.3 rpoB基因测序                                    2.1  298株MTB分子和表型药敏结果比较
                  采用 Mericon  TM  DNA Bacteria Kit（Qiagen 公司，        共纳入298株RIF 分子与表型药敏均为阳性的
              美国）进行DNA提取。首先，刮取培养基上长势良好                          菌株。其中，分子耐药82株，分子敏感216株；表型
              的菌落，放于内含200 μL细菌裂解液的2 mL离心管                       耐药 75 株，表型敏感 223 株（表 1）。分子药敏检出
              中。然后在涡流机上充分振荡后，置于200 ℃金属浴                         耐药的灵敏度为 93.3%（95%CI：87.7%~99.0%），特
              中加热10 min，再13 000 r/min离心5 min，最终取上               异度为 94.6%（95%CI：91.4%~97.3%），阳性预测值
              清液放于新离心管中以备用。rpoB 基因扩增所用                          为 86.4%（95%CI：77.7%~93.0%），阴性预测值为

              引物为 rpoB⁃F：5′⁃TACGGTCGGCGAGCTGATCC⁃3′             96.7%（95%CI：95.7%~99.7%），约登指数为 88.0%，
              和 rpoB⁃R：5′⁃TACGGCGTTTCGATGAACC⁃3′（由深             准确率达 94.3%，与表型药敏结果的一致性较高
              圳华大基因公司合成），扩增产物的序列大小为                            （kappa=0.852，P < 0.001）。

              411 bp。PCR扩增采用50 μL的反应体系，包括5 μL
                                                                         表1 MTB分子和表型药敏结果比较
              的模板 DNA，上下游引物各 1.5 μL，ddH2O 17 μL，
                                                                 Table 1  Comparison of phenotypic and molecular drug
              EasyTaq PCR Super Mix（2×）25 μL（北京全式金生物                     sensitivity results of MTB  （n=298）
              有 限 公 司）。 具 体 过 程 如 下 ：95 ℃ 变 性 5 min；              Molecular drug  Phenotypic drug sensitivity of RIF
              94 ℃变性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 10 min，            sensitivity    Resistance   Sensitivity  Total
              循环 30 次。扩增产物采用 1%琼脂糖凝胶电泳检                           Resistance        70          012       082
              测。PCR产物送浙江圣庭医学检验中心测序。利用                             Sensitivity       05          211       216
              DNAman软件对基因的突变位点、形式及突变率进行                           Total             75          223       298
              分析，并用BLAST软件与H37RV菌株基因进行序列                        2.2  分子耐药患者的临床特征
              比对。以大肠杆菌编号系统为基础进行研究分析。                                 82 例 RIF 分子耐药患者中位年龄为［41（38，
              1.2.4 RIF和RFB的MIC测定                               56）］岁，男性占 61.0%。67.1%有肺结核治疗史，
                  药物的 MIC 检测采用分枝杆菌微孔法药敏试                        47.6%合并糖尿病。送检标本以肺泡灌洗液为主
              剂盒（珠海银科医学工程有限公司）进行。RIF 和                         （61.0%，表2）。
              RFB 药物浓度分别设定为0.125、0.250、0.500、1.000、             2.3  rpoB基因突变谱与表型药敏的对应关系
              2.000、4.000、8.000 μg/mL，依据国家药品监督管理                     82 株 RIF 分子耐药菌株中，79 株（96.3%）检出
              局批准的厂家说明，微孔板法判读标准基于临床和                            rpoB 基因突变。最常见的突变是密码子 531（TCG
                                              ［16］
              实验室标准研究所（CLSI）M24A建议 ：≤1.0 μg/mL
              表示敏感，2.0 μg/mL 表示低度耐药，≥4.0 μg/mL 表                        表2 82例RIF分子耐药患者的临床特征
              示高度耐药。质控 MTB 标准菌株（H37Rv）同步进                        Table 2  Clinical features of 82 patients with molecular
              行微孔板的操作。                                                   resistance to RIF            ［n（%）］

              1.3  统计学方法                                                  Characteristics            Case
                                                                    Male                            50（61.0）
                  采用 SPSS 26.0 统计软件进行数据分析。计数
                                                                    Female                          32（39.0）
              资料以例数和百分比［n（%）］表示；计量资料经 Sha⁃
                                                                    History of tuberculosis         55（67.1）
              piro⁃Wilk 检验证实不符合正态分布，故以中位数（四
                                                                    Diabetes                        39（47.6）
              分位数）［M（P25，P75）］表示。以传统表型药敏结果为
                                                                    Hypertension                    17（20.7）
              金标准，计算分子药敏（Xpert）检测RIF耐药的灵敏                           Specimen type
              度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确率及约登                                Sputum                        32（39.0）
              指数，并采用 Kappa 检验评估两种方法的一致性。                              Bronchoalveolar lavage fluid  50（61.0）
   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75