Page 40 - 南京医科大学自然版
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第46卷第6期
               ·822  ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年6月


              脉血管平滑肌细胞（human pulmonary artery smooth            高温变性。使用7.5%~12.5%梯度范围的SDS⁃PAGE
              musclecell，HPASMC）（Lonza 公司，美国）；血管内皮              电泳分离约30 μg蛋白质，随后转移至NC膜或甲醇
              生长因子受体抑制剂 SU5416、Ⅰ型胶原酶、Ⅲ型弹                        活化的 0.45 μm PVDF 膜上。转膜结束后，置于含
              性蛋白酶（Sigma 公司，美国）；DMEM 培养基、Lipo⁃                  5%脱脂牛奶的 TBST（含 0.1%Tween 20 的 Tris 缓冲
              fectamine TM  3000、Lipofectamine TM  RNAiMAX（Invitro⁃  液，pH 7.4）中室温封闭 1 h。在 4 ℃下，将膜与相应
              gen公司，美国）；SmGM⁃2 BulletKit 培养基（Lonza 公            的一抗孵育过夜。次日，使用 TBST 洗涤 3 次，每次
              司，美国）；胎牛血清（Gibco 公司，美国）；人 SMOC2                   10 min。在室温下，孵育相应种属的二抗溶液 1 h。
              重组蛋白（R&D Systems 公司，美国）；EdU 细胞增殖                  TBST 洗涤 3 次，每次 10 min，随后基于 HRP 的化学
              检测试剂盒、SMOC2双链小干扰RNA（siS1和siS2）、                   发光法检测免疫印迹。
              miR⁃125a 和 miR⁃150 模拟物（ miR⁃125a mimic 和          1.2.4  免疫荧光染色分析
              miR⁃150 mimic ）（广州锐博公司）；pGL3⁃Promoter载                 将组织切片置于 10 mmol/L 柠檬酸缓冲液（pH
              体、荧光素酶报告基因检测系统（Promega 公司，美                       6.0）中，于98 ℃加热10 min 进行抗原修复。待切片
              国）；TRIzol 试剂（Takara 公司，日本）；SMOC2 抗体               自然冷却至室温后，使用含0.3% TritonX⁃100的PBS

             （Santa Cruz 公司，美国）；α⁃平滑肌肌动蛋白（alpha⁃                穿透10 min，PBS洗涤3次，每次5 min，然后用3%牛
              smooth muscle actin，α ⁃ SMA）抗 体 、钙 调 蛋 白 ⁃ 1      血清白蛋白封闭液室温封闭1 h，以阻断非特异性结
             （Calponin1）抗体、增殖细胞核抗原（proliferating cell           合位点。随后，切片在 4 ℃条件下与用封闭液稀释
              nuclear antigne，PCNA）抗体、微管蛋白（Tubulin）抗            的种属特异性一抗过夜孵育。一抗孵育结束后，用
              体（CST 公司，美国）；β⁃肌动蛋白（β⁃actin）抗体                    含 0.05% Tween 20 的 PBS 溶液洗涤切片 3 次，随后
             （bioworlde 公司，美国）；山羊抗兔 IgG 二抗、山羊抗                  在室温避光条件下与 Alexa Fluor 标记的二抗孵育
              小鼠IgG二抗（巴傲得公司）。                                   2 h，弃二抗，使用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 min。细胞
              1.2  方法                                           核采用4’，6⁃二脒基⁃2⁃苯基吲哚（4’，6⁃diamidino⁃2⁃
              1.2.1  慢性缺氧诱导PH小鼠模型                               phenylindole，DAPI）进行复染，并用奥林巴斯显微镜
                  将8周龄雄性C57BL/6小鼠置于常压低氧舱中                       采集荧光图像。实验全程设置了严格的阴性对照，
              持续饲养 4 周，舱内氧浓度维持在 10%。同期设置                        包括未加一抗的空白对照及同型抗体对照。
              匹配的对照组，在常氧条件下（21%O2）饲养相同时                         1.2.5  细胞分离、培养和转染
              长。低氧混合气体以约 1 L/min 的流速持续通入舱                            小鼠、大鼠 PASMC 的分离与培养：取 6~8 周龄
              内，全程监测舱内温湿度。实验结束时，对小鼠实                            的大、小鼠经异氟醚麻醉后，颈椎脱位实施安乐
              施安乐死并采集组织样本。                                      死。全身用 75%乙醇消毒。随后于无菌条件下逐
              1.2.2  SU5416联合低氧诱导PH大鼠模型                         层剪开皮肤，暴露胸腔，完整地分离心肺组织，置于
                  Su/Hx大鼠模型采用药物抑制联合慢性低氧的                        预冷的无菌 PBS 中。使用显微镊向远端分离肺动
              方法构建。雄性 SD 大鼠单次皮下注射血管内皮生                          脉并去除血管外膜，随后将肺动脉切成小块，使用
              长因子受体抑制剂 SU5416（20 mg/kg）后，随即置于                   1 mg/mLⅠ型胶原酶和 0.125 mg/mL Ⅲ型弹性蛋白
              低氧舱（10% O2）中持续暴露 3 周，以启动肺血管重                      酶消化 30 min，经 45 μm 细胞筛过滤，500 g 离心
              构过程。随后，将大鼠移回常氧环境继续饲养3周，                           5 min，弃上清。使用含20%胎牛血清的DMEM培养
              以促进严重且不可逆的PH病变形成。对照组大鼠                            基重悬细胞，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养，3 d
              则在整个6周实验期间，于常氧条件下饲养，并接受                           后换液。等细胞长满传代后更换为含 10%胎牛血
              等体积溶剂注射。实验结束时，对大鼠实施安乐死                            清的DMEM培养基，持续至第3次传代，进行后续实
              并采集组织样本。                                          验。体外低氧诱导实验中，将已接种PASMC的培养

              1.2.3  Western blot分析                             皿置于含有 3% O2及 5% CO2的密闭培养箱内进行
                  使用含有蛋白酶抑制剂混合物的 RIPA 裂解                        处理。
              液，低温裂解、提取培养的细胞或肺组织样品中的                                 人 PASMC 细胞培养于含 5%胎牛血清、生长因
              蛋白质，裂解产物经4 ℃、12 000 g离心15 min，取上                  子及抗生素的 SmGM⁃2 BulletKit 培养基。常氧实验
              清，并使用 BCA 法定量上清液中的蛋白质浓度，调                         条件下，细胞置于 37 ℃恒温、持续供应空气（21%
              整蛋白终浓度为2 mg/mL，加入6×SDS上样缓冲液，                      O2）及5% CO2的湿润培养箱中培养。体外低氧诱导
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