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第46卷第6期             朱天帆，陈     峰，黄惠结. SMOC2促进低氧诱导的肺血管平滑肌细胞表型转换［J］.
                  2026年6月                      南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（6）：820-831                      ·823  ·


                                                                  层细胞上制造划痕，并于初始时刻拍摄图像记录。
                实验中，将已接种 PASMC 的培养皿置于含有 3% O2
                及 5% CO2的密闭培养箱内进行处理。HEK293T 细                     随后将细胞置于 21%或者 3% O2 条件下继续培养
                胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基。本研究使                         24 h，再次拍摄图像以量化细胞迁移率。
                                                   TM
                              TM
                用 Lipofectamine 3000 与 Lipofectamine RNAiMAX      1.2.8  双荧光素酶报告基因检测
                进行转染，操作严格遵循产品说明书进行。                                   将含有 miR⁃125a 与 miR⁃150 潜在结合位点的
                1.2.6  PASMC增殖实验                                  SMOC2 cDNA 3′UTR片段及其种子序列突变体分别
                    细胞增殖检测：采用 5⁃乙炔基⁃2’⁃脱氧尿苷                       克隆至pGL3⁃Promoter载体的荧光素酶基因下游（报
               （EdU）掺 入 法 ，使 用 EdU 细 胞 增 殖 检 测 试 剂 盒              告基因质粒均由金斯瑞公司构建），构建的重组荧光
               （RiboBio）测定。将 2×10 个 PASMC 接种于 24 孔板               素酶报告质粒分别命名为SMOC2⁃WT与SMOC2⁃mut。
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                中，利用RNAiMax转染SMOC2 siRNA（SiS1、SiS2）或              使用Lipofectamine 3000将上述报告质粒与miR⁃125a、
                者 miR⁃125a、miR⁃150 模拟物（miR⁃125a mimic 和           miR⁃150 mimic 或其对照共转染至 HEK293T 细胞。
                miR⁃150 mimic）36 h，随后进行血清饥饿过夜处理，                  转染48 h后，采用双荧光素酶报告基因检测系统检
                再置于 21%或者 3% O2条件下继续培养 24 h，更换                    测萤火虫荧光素酶活性，并以海肾荧光素酶活性作
                培养基，加入含 50 μmol/L EdU 的新鲜培养基。孵                    为内参进行标准化处理。
                育 4 h 后，PBS 洗涤细胞 2 次，并用 4%（W/V）多聚甲                1.2.9  实时荧光定量PCR分析
                醛/PBS固定，后续步骤按试剂说明书进行。通过荧                              采用 TRIzol 试剂提取细胞或组织中的总 RNA，
                光显微镜拍摄图片，Image J 软件计算EdU阳性细胞                      随后使用 NanoDrop 分光光度计测定 RNA 浓度与纯
                百分比。                                              度。取 1 μg 总 RNA，按照逆转录试剂盒说明书将
                1.2.7  PASMC迁移实验                                  其逆转录为 cDNA。实时荧光定量 PCR 反应使用
                    采用划痕愈合实验评估 PASMC 的迁移能力。                       SYBR Green 预混液，在 CFX Connect 实时荧光定量
                将 PASMC 培 养 于 6 孔 板 中 ，通 过 RNAiMax 转 染            PCR 检测系统上进行。每个样本均设置 3 个复
                                                                                                           -ΔΔCt 法
                SMOC2 siRNA（siS1、siS2）或者 miR⁃125a、miR⁃150         孔。目标基因的相对 mRNA 表达水平采用 2
                模拟物（miR⁃125a mimic 和 miR⁃150 mimic）36 h，随         进行计算，并以内参基因进行标准化。引物序列见
                后进行血清饥饿处理过夜。使用移液器吸头在单                             表1。

                                                        表1 PCR引物序列
                                                   Table 1  PCR primer sequences

                         Gene                                   Primer sequence（5’→3’）
                        miR⁃125a          RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAGGT
                                          Forward：TCCCTGAGACCCTTTAAC
                                          Reverse：GTGCAGGGTCCGAGGT
                        miR⁃150           RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACTGGT
                                          Forward：TCTCCCAACCCTTGTACCA
                                          Reverse：GTGCAGGGTCCGAGGT
                        U6                RT：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAATATGG
                                          Forward：ATTGGAACGATACAGA
                                          Reverse：GTGCAGGGTCCGAGGT

                1.3  统计学方法                                        组间比较采用单因素方差分析，并用Tukey’s检验进
                    使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行图表绘制与               行组间差异比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
                统计分析。所有数据均以均值±标准差（x ± s）表示，
                                                                  2 结    果
                实验至少独立重复 3 次。使用 Shapiro⁃Wilk 检验评
                估数据的正态性，并且通过Brown⁃Forsythe检验评估                    2.1 SMOC2在PH肺组织中高表达且富集于PASMC
                组方差的同质性。对于方差相等的两组之间的比                                 与对照组相比，慢性缺氧诱导的 PH 小鼠、
                较，使用 Student’s t 检验，而 Welch 校正应用于涉及               SU5416 联合低氧诱导的 PH 大鼠以及 PH 患者肺组
                方差不等的两组的分析。两组间比较采用t检验，多                           织中，SMOC2 蛋白表达均显著升高（图 1A、B）。免
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