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第46卷第7期 吴宇轩，袁闻婕，卫一敏，等. 3⁃HK介导双酚F致小鼠抑郁的机制及亮氨酸的干预作用［J］.
2026年7月 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（7）：963-972，990 ·965 ·

1.2 方法 实验或在-80 ℃冻存待后续分析。脑组织样品：准
1.2.1 动物分组及模型建立 确称取相应样本（10 mg）于离心管中，加入 500 μL
C57BL/6J 小鼠适应性饲养 1 周后，将其随机分 冰萃取液（甲醇∶水=3∶1，V/V），50∶1 混合内标溶液
为 3 组：对照组、BPF 暴露组［BPF 40 μg/（kg·d）］、 以及 1~2 粒不锈钢珠（直径=3 mm），于组织匀浆仪
BPF+Leucine 组［ BPF 40 μ g/（ kg · d ）+ 亮 氨 酸 TissueLyserⅡ（Dusseldorf 公司，德国）中进行匀质
50 μ g/（kg·d）］。 化，重复两次，并进行衍生化处理。
BPF 暴露剂量的选择［40 μg/（kg·d）］参考既往 利用 Q Exactive 四级杆轨道阱高分辨质谱仪
实验室发表的学术论文，该剂量被美国国家环境保 （赛默飞世尔科技公司，美国）、Ulimate3000 超高效
护局认为是每日暴露的“安全”剂量；同时，课题组 液相色谱仪系统（赛默飞世尔科技公司，美国），检
［13］
发现该剂量下能稳定诱发小鼠抑郁样行为 。亮氨 测脑组织 Trp、5⁃HT、Kyn、KynA、3⁃HK、QA、NA、
酸的干预剂量［50 μg/（kg·d）］主要依据该剂量下亮 NAM水平。
氨酸能通过与LAT⁃1竞争性结合，减少Kyn入脑 。 液相色谱与质谱检测采用 SCIEX Triple Quad TM
［14］
所有处理均通过灌胃途径进行。BPF暴露组每 5500+系统⁃QTRAP Ready 系统。色谱柱：Acquity
TM
日灌胃给予上述剂量的 BPF 溶液；BPF+Leucine 组 UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.8 μm）；柱温：40 ℃；采
在同一时间点同步给予含有 BPF 与亮氨酸的混合 用反相色谱梯度洗脱分离，流动相A为含0.1%甲醇
溶液；溶剂对照组灌胃等体积的生理盐水。灌胃处 的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯
理每日1次，持续30 d，然后进行焦虑抑郁相关行为 度洗脱程序如下：0~0.5 min，99% A；0.5~2.0 min，A
学测试。 相由 99%线性降至 30%；2.0~4.0 min，A 相由 30%线
1.2.2 旷场实验（open field test，OFT） 性降至 5%；4.0~5.0 min，保持 5% A；5.1~7.0 min，恢
通过 OFT 观察小鼠焦虑程度，中央区域停留 复至 99% A 并平衡至运行结束。色谱流速设定为
时间、穿越中央区域的频率与次数共同反映动物 0.25 mL/min，进样量为2 μL。质谱采用电喷雾电离
的焦虑情况及对周围环境的不确定性和对周围环 源，多反应监测模式进行数据采集，扫描分辨率为
境中可能存在的危险性的观察。实验过程中，将小 70 000。其余质谱参数设置如下：电喷雾电压30 kV，
鼠小心放置于旷场中央区域后任其自由探索6 min， 毛细管温度 350 ℃，加热器温度 500 ℃，鞘气流量
利用摄像头和软件监测记录其在不同区域的活动 55 arb，辅助气流量55 arb，吹扫气流量35 arb。其中
情况。 arb为仪器自设参数单位（arbitrary units）。使用 Analyst
1.2.3 高架十字迷宫（elevated plus maze，EPM） 软件进行数据采集和分析。
将小鼠放置在EPM的开臂与闭臂接合处；打开 1.2.7 qRT PCR检测mRNA表达水平
录像记录系统，记录小鼠在 EPM 内的活动，总时间 取脑组织 10 mg 于匀浆管中，加入 1 mL TRIzol
5 min；试验结束后将小鼠放回笼内。 和无酶匀浆珠，充分研磨后加入 200 μL 氯仿，混匀
1.2.4 悬尾实验（tail suspension test，TST） 静置后离心。转移上清至洁净 EP 管，加入 500 μL
从小鼠的尾部1/3开始，将其悬于试验箱中，其头 异丙醇，震荡静置离心。弃上清并用无水乙醇洗涤
部离箱底约10 cm。将TST期间小鼠6 min内放弃挣 沉淀，重复 2 次；室温干燥后加入适量 DEPC 水溶
扎并停止不动的时间用摄像系统观察并记录。小鼠 解，进行浓度测定或4 ℃保存。
放弃主动挣扎，身体垂悬不动即为不动状态的标准。 采用梯度 PCR 仪行逆转录获得 cDNA。定量

1.2.5 强迫游泳（forced swimming test，FST） PCR 采用样本反应体系（cDNA+DEPC 水）与引物体
将小鼠放入洁净水［温度（24±1）℃］的大烧杯 系（SYBR Green+前后引物）在Roche LightCycler 480Ⅱ
中，强迫其游泳，并对各处理组小鼠进行测试。使 荧光定量系统上完成。以 GAPDH 作为内参基因，
用摄像头观察并记录 FST 期间 6 min 内实验小鼠静 采用2 -ΔΔCT 法计算基因相对表达量，所有实验均重复
止不动的时间。 3次。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合

1.2.6 超高效液相色谱⁃串联质谱联用法（ultra⁃high 成，具体序列见表1。
performance liquid chromatography⁃tandem mass spec⁃ 1.2.8 原代神经元细胞的分离培养和鉴定
trometry，UHPLC⁃MS/MS）检测脑组织神经递质水平 麻醉孕18 d SD大鼠，处死后取胎鼠全脑置于含
小鼠麻醉后处死，收集脑组织，立即进行相关 马血清并提前预冷的DMEM/F12培养基中。分离海