Page 20 - 南京医科大学自然版
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第46卷第7期
               ·966 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2026年7月


                                                        表1 引物序列
                                                    Table 1 Primer sequences

                    Gene                      Forward（5′→3′）                          Reverse（5′→3′）
                    IDO1               TTCACGCAAGACTGGCTGAA                     AGGCGATGGAGTTCTTCAGG
                    IFN⁃γ              ATGAACGCTACACACTGCATC                    CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC
                    IL⁃1β              GAAATGCCACCTTTTGACAGTG                   TGGATGCTCTCATCAGGACAG
                    TNF⁃α              CCCTCACACTCAGATCATCTTCT                  GCTACGACGTGGGCTACAG
                    TPH2               CCACCATTGTGACCCTGAATCC                   ATGAGGACTCGGTGAGAGCATC
                    KMO                TGATGTGTACGAAGCTAGGGA                    TCATGGGCACACCTTTGGAAA

              马和皮层组织后，用木瓜酶和 DNA 酶消化组织，过
                                                                2 结     果
              滤后收集细胞悬液，1 000 r/min 室温离心 5 min，弃
              上清，重悬细胞并计数，调整密度为 1×10 个/cm 。                      2.1 亮氨酸可逆转BPF暴露引起的小鼠抑郁样行为
                                                           2
                                                     5
              使用原代神经元培养基 Neurobasal+B⁃27（Thermo⁃                     将小鼠随机分为对照组、BPF 暴露组、BPF+
              fisher 公司，美国）培养。培养至第 7 天后，神经元                     Leucine组，分别处理30 d后进行焦虑抑郁相关行为

              突出发育成熟，利用抗微管相关蛋白 2 抗体（anti⁃                       学测试。与对照组相比，在OFT中，BPF暴露组小鼠
              microtubule⁃associated protein 2 antibody，anti⁃MAP⁃2）  的中央活动频率降低、次数减少、距离缩短（图 1A、
              对其进行标记及鉴定。                                        B）；在 EPM 实验中，BPF 暴露组小鼠在开放臂中的
              1.2.9  Hoechst染色观察神经元细胞核形态                        停留时间显著缩短（图 1C、D）。TST 和 FST 的实验
                  细胞利用4%多聚甲醛固定液，固定10 min。用                      结果显示，相比对照组，BPF暴露组小鼠的不动时间
              PBS 清洗后，滴加至载玻片上。晾干后，均匀加入                          延长（图1E、F）。以上结果提示，BPF暴露后的小鼠
              Hoechst染色液，染色5 min，滴加抗荧光淬灭封片液                     表现出快感缺乏与绝望行为，出现抑郁样行为，而
              于载玻片上，激光共聚焦显微镜观察细胞情况。                             上述行为在亮氨酸作用后明显逆转。
              1.2.10  DCFH⁃DA 荧光探针法检测神经元活性氧                     2.2  亮氨酸可纠正 BPF 暴露引起的小鼠海马与大
             （reactive oxygen species，ROS）水平                    脑皮层神经递质代谢紊乱
                  BPF 共孵育与 KMO 抑制剂干预：将神经元随                           基于上述 BPF 暴露引起的小鼠抑郁样表型，进
              机分为对照组、BPF 组、GSK180 组和 BPF+GSK180                 一步观察 BPF 暴露后小鼠海马体与大脑皮层中神
              共处理组。在 BPF 干预前，用 KMO 抑制剂 GSK180                   经递质的变化。借助UHPLC⁃MS/MS 技术对小鼠前
             （2 μmol/L）与神经元细胞共孵育 2 h，再用 PBS 洗去                  额皮层和海马组织中的神经递质水平进行检测，结
              残留的抑制剂，进行 BPF（100 μmol/L）干预。3⁃HK                  果显示，与对照组相比，BPF 暴露后，小鼠海马体中
              共孵育：将神经元随机分为对照组（Control）和3⁃HK                     Trp、5⁃HT、NAM 和 NA 含量无明显变化，Kyn、KynA
              组（100 μmol/L）。原代神经元进行 3⁃HK 染毒，24 h                和QA含量显著减少，3⁃HK含量显著增高；与BPF暴
              后，上述处理后的对照组、BPF 处理组、对照与                           露组比较，BPF+Leucine 组的Trp、5⁃HT、Kyn、KynA、
              GSK180共处理组、BPF与GSK180共处理组和3⁃HK                    QA 和 NA 含量未发现显著变化，而 3⁃HK 和 NAM 含
              实验组分别加入适量浓度为10 μmol/L的DCFH⁃DA                     量显著降低（图2）。在前额皮层中，与对照组相比，
              工作液，再用无血清培养基洗涤细胞。后用激光共                            BPF 暴露后 Trp、Kyn 和 KynA 含量显著降低，3⁃HK
              聚焦显微镜进行观察。                                        含量显著升高，5⁃HT、QA、NA及NAM含量无显著变
              1.3 统计学方法                                         化；BPF+Leucine 组仅 3⁃HK 含量较 BPF 组显著降
                  使用 SPSS 27.0 软件进行实验数据的统计与                     低，其余指标差异均无统计学意义（图3）。
              分析，GraphPad Prism 5.0 软件进行统计学绘图。                  2.3  亮氨酸可抑制 BPF 暴露引起的小鼠海马和皮
              计量资料以均数±标准差（x ± s）表示。两组定量                         层中KMO过表达及神经炎症反应
              数据比较用 Student’s t test；多组定量资料比较采                       BPF 暴露后，3⁃HK 生成的关键酶 KMO 在小鼠
              用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）检验，两两                      海马和皮层中表达水平显著升高（海马：F=28.10，
              比较采用 Dunnett⁃t 检验。P < 0.05 为差异有统计                 P < 0.05；皮层 F=28.25，P < 0.05，图 4A、5A）。同时
              学意义。                                              炎症因子干扰素⁃γ（interferon gamma，IFN⁃γ）、白介
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