Page 76 - 南京医科大学自然版

第46卷第7期
·1022 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2026年7月

日本）；病毒生长培养基（Gibco 公司，美国）；1%鸡 不同组别的疫苗制剂（均为混合后终浓度）。SNP组：
红细胞（江苏鸿泉生物科技有限公司）；牛血清白 调整三价裂解疫苗原液总HA终浓度为100 μg/mL，
蛋 白（bovine serum albumin，BSA）、四甲基联苯胺 SNP终浓度为300 μg/mL。接种时，每只小鼠取20 μL
（tetramethylbenzidine，TMB）（Becton Dickinson 公司， （含2 μg总HA、6 μg SNP）经鼻喷接种。Alum⁃CpG组：
美 国）；辣 根 过 氧 化 物 酶（horseradish peroxidase， 调整三价裂解疫苗原液总HA终浓度为100 μg/mL，
HRP）标记的山羊抗小鼠 IgA 二抗（Abcam 公司，美 Alum 终浓度为 5 mg/mL，CpG 终浓度为 1.25 mg/mL。
国）；即用型三溴乙醇溶液（南京爱贝生物科技有限 接种时每只小鼠取20 μL（含2 μg总HA、100 μg Alum
公司）；MDCK 细胞、A/Scotland/P2/2015（H1N1）毒株 和25 μg CpG）经肌肉注射接种。Split vaccine组：调
由中科南京生命健康高等研究院提供。 整三价裂解疫苗原液总HA终浓度为100 μg/mL，接
所有动物实验经中科南京生命健康高等研究 种时每只小鼠取 20 μL（含 2 μg 总 HA）经肌肉注射
院动物伦理委员会审批通过（NAALH⁃N⁃2507004）。 接种。

1.2 方法 1.2.2 流感病毒鸡胚扩增
1.2.1 疫苗制备 实验前，将各流感病毒疫苗株用 PBS 稀释 1×
三价裂解疫苗原液制备：将 WHO 推荐的流感 10 倍；取稀释后病毒液100 μL接种于9日龄SPF级
5
病毒疫苗株接种于 SPF 鸡胚。经培养收获尿囊液， 鸡胚尿囊腔。接种后的鸡胚置于（37.0 ± 0.5）℃、相
通过灭活工艺处理后，进行超滤纯化，制备各单价 对湿度 60% ± 5%的孵化箱中孵育 72 h。孵育结束
原液。随后，将各单价原液等比例混合，以总血凝 后，将鸡胚转移至4 ℃冷胚过夜，随后无菌操作收获
素（hemagglutinin，HA）定量结果为准，将所得三价 尿囊液。
裂解疫苗原液的总HA浓度调整至合适水平备用。 收集的尿囊液 4 ℃、3 500 r/min 离心 20 min，取
SNP 构建：将 GLA、3M⁃052、二棕榈酰磷脂酰胆 上清液，采用1%鸡红细胞悬液进行血凝试验。选取
碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺⁃甲氧基聚乙二醇2000、 血凝效价 ≥ 256的阳性尿囊液，再次4 ℃、3 500 r/min
胆固醇及α⁃生育酚溶于氯仿中，经旋转蒸发去除有 离心20 min，将上清液分装后置于-80 ℃超低温冰箱
机溶剂形成脂质膜。加入25 mmol/L 磷酸盐缓冲液 保存，以备后续血凝抑制（hemagglutination inhibition，
（phosphate⁃buffered saline，PBS）水合，混合物置于 HI）试验使用。
60 ℃水浴超声处理 1 h。随后使用微流控设备在 1.2.3 小鼠免疫接种
18 000 psi 压力下进行 5 个循环挤压，经 0.22 μm 滤 选取80只8周龄雌性SPF级BALB/c雌性小鼠，
膜过滤制得SNP，储存于2~8 ℃备用。 随机分为4组，每组20只，前3组分别按前述方法进
各免疫组疫苗制备：将三价裂解疫苗原液与各 行疫苗接种，第4组为未免疫对照（Control）组，免疫
佐剂进行混合，通过室温缓慢搅拌12 h，最终制备成 方案见表1。

表1 实验动物免疫方案
Table 1 Experimental animal immunization protocol
Group Immunization route HA immunization dose Number of mouse Immunization schedule
SNP Intranasal 2 μg 20 2 immunizations，21⁃day interval
Alum⁃CpG Intramuscular 2 μg 20 2 immunizations，21⁃day interval
Split vaccine Intramuscular 2 μg 20 2 immunizations，21⁃day interval
Control Intramuscular 0 20 2 immunizations，21⁃day interval

1.2.4 小鼠血清采集及处理 1.2.5 小鼠鼻腔灌洗液（nasal lavage fluid，NLF）
小鼠加强免疫14 d后，进行颌下静脉采血。采 采集
集的全血室温静置2 h后4 ℃过夜，3 500 r/min 离心 在加强免疫后第 14 天采集小鼠 NLF。小鼠安
10 min，吸取上层血清。采用 RDE 预处理血清，以 乐死后暴露小鼠气管，将吸有 PBS 的注射器插入气
PBS 溶解 RDE 为工作液，按 1∶3 的比例将血清与 管，向鼻腔方向缓慢推注液体，将从鼻孔流出的NLF
RDE混合，37 ℃水浴过夜后56 ℃金属浴30 min灭活 收集于离心管中，于4 ℃、3 000 r/min离心10 min，收
RDE，获得待检血清。 集上清备用。