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第46卷第7期 李永琪，蒋正东，张玮欣，等. 流感病毒裂解疫苗佐剂对比：Alum⁃CpG肌肉注射与糖纳米颗粒鼻喷递送
                  2026年7月           的免疫保护效果评价［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（7）：1020-1028                  ·1023 ·


                1.2.6  小鼠血清HI试验                                   织匀浆上清的半数组织培养感染剂量（50% tissue
                    参照《全国流感监测技术指南》进行 HI 试验。                       culture infective dose，TCID50），根据肺组织重量换算
                以完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释倍数作为                             为每克肺组织的TCID50 （TCID50/g），经对数转换后得
                HI抗体滴度；未见抑制者记为HI滴度< 10。每组检                        到 lg（TCID50/g），结果以此形式表示。每组检测 5 只
                测10只小鼠的血清样本。                                      小鼠的肺组织病毒载量。
                1.2.7  小鼠 NLF 中分泌型免疫球蛋白 A（secretory               1.2.10  小鼠肺病理切片
                immunoglobulin A，sIgA）检测                              攻毒后第 4 天，取小鼠肺组织置于 4%多聚甲
                    采用间接酶联免疫吸附试验检测小鼠 NLF 中                        醛中固定。随后由中科南京生命健康高等研究院

                流感病毒抗原特异性sIgA。将A/Victoria/4897/2022               动物实验平台完成石蜡包埋、切片及苏木精⁃伊红
               （H1N1）单价裂解疫苗作为包被抗原，用 0.05 mol/L                   （hematoxylin⁃eosin，HE）染色。采用数字切片扫描
                碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释 HA 至终浓度 1 μg/mL，                 系统获取图像。使用 Image J 软件对每张切片进行
                100 μL/孔加入96孔酶标板，4 ℃包被过夜。次日用                      定量分析：在 10 倍视野下，随机选取 5 个非重叠视
                2% BSA封闭1 h，用含0.1% Tween⁃20的磷酸盐缓冲                 野，测定炎症面积占视野总面积的百分比，取平均值
                液（phosphate buffered saline with Tween⁃20，PBST）洗  作为该小鼠的炎症面积结果。每组检测5只小鼠。
                板 3 次。将 NLF 样本进行 10 倍稀释，再以 2 倍梯度                  1.3  统计学方法
                连续稀释，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h。洗板后                         所有统计学分析均采用 GraphPad Prism 9 软件

                每孔加入1∶5 000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgA                       完成。各组样本量主要依据前期预实验结果、既往
                二抗，37 ℃孵育1 h。经洗板后加入TMB显色，37 ℃                     相关文献以及动物伦理原则综合确定。抗体滴度和
                避光反应30 min，终止后于酶标仪上测定450 nm吸                      病毒载量以对数转换后数据的均值±标准误（x ± sx）
                光度值。以Control组吸光度均值的2.1倍作为阳性                       表示；肺组织炎症面积占比以均值 ± 标准误（x ± sx）
                判定阈值，吸光度值高于该阈值的最高样本稀释倍                            表示。组间比较方法如下：对多组数据采用单因素
                数定义为该样本的sIgA滴度。每组检测5只小鼠的                          方差分析（one⁃way ANOVA），并结合Dunnett多重比
                NLF样本。                                            较检验或 Tukey 多重比较检验进行两两比较；因
                1.2.8  小鼠攻毒实验                                     SNP 组针对 H3N2 的 HI 抗体滴度、Alum⁃CpG 组病
                    小鼠加强免疫后 21 d，采用 A/Scotland/P2/2015            毒载量均低于检测下限，经统一赋值后组间方差
               （H1N1）流感病毒株进行攻毒。对小鼠腹腔注射三                           不齐，均采用 Brown⁃Forsythe 和 Welch ANOVA 进行
                溴乙醇麻醉后，经鼻腔滴注50 μL的10×半数致死量                        整体比较，并进一步以 Split vaccine 组为参照进行
               （lethal dose 50，LD50）病毒液。攻毒后连续 14 d 监              Dunnett’s T3多重比较检验。生存曲线采用Kaplan⁃
                测小鼠体重变化百分率和存活情况，每组检测10只                           Meier法绘制，统计学分析采用Log⁃rank（Mantel⁃Cox）
                小鼠。                                               检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
                1.2.9  小鼠肺组织病毒载量测定
                                                                  2 结    果
                    攻毒后第 4 天取小鼠肺组织，制备 10%肺组织
                匀浆。取传代20代以内的MDCK细胞，消化后调整                          2.1 流感病毒疫苗株血凝效价测定
                细胞密度至 1.5 × 10 个/mL，接种于 96 孔细胞培养                      流感病毒疫苗株接种鸡胚 72 h 后取上清液测
                                  5
                板中，每孔 200 μL，37 ℃、5% CO2培养 20 h，待细胞               定血凝效价，所扩流感病毒疫苗株 A/Victoria/4897/
                融合度达 90%进行实验。将肺组织匀浆上清用病                           2022（H1N1）、A/Wisconsin/1009/2024（H3N2）以及B/
                毒生长培养基进行 10 倍梯度稀释。弃去 MDCK 细                       California/0855/2024（B/Victoria）的血凝效价均为256。
                胞培养板中培养基，以病毒生长培养基清洗1次后，                           2.2  小鼠血清对流感病毒的HI抗体滴度测定
                每孔加入100 μL不同稀释度的样本，每个稀释度设                             在加强免疫后第14天采集小鼠血清，分别以各
                置4个复孔。于37 ℃、5% CO2条件下吸附2 h后，弃                     流感病毒疫苗株为抗原进行HI试验，以评价不同免
                去接种液，再次清洗，每孔加入 200 μL 病毒生长培                       疫组诱导的 HI 抗体水平。如图 1A 所示，各组针对
                养基，继续培养72 h。                                      A/Victoria/4897/2022（H1N1）的 HI 抗体滴度存在显
                    培养结束后观察细胞病变，并结合血凝试验判                          著差异（P < 0.001）。其中，Alum⁃CpG 组显著高于
                定病毒感染阳性孔。采用Reed⁃Muench法计算肺组                       Split vaccine 组（P < 0.001），而 SNP 组显著低于 Split
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