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第46卷第7期        曹丹丹，倪思琦，王迎伟，等. JNK上调HOXB4基因表达对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响［J］.
                  2026年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（7）：953-962                        ·955 ·


                Mix for qPCR试剂（南京诺唯赞生物科技有限公司）。                    例接种至新培养皿。
                1.2  方法                                           1.2.3  反转录⁃聚合酶链反应（reverse transcription⁃
                1.2.1  数据库数据分析                                    polymerase chain reaction，RT⁃PCR）
                    通过中国胶质瘤基因组图谱（Chinese Glioma                       引物设计步骤：从 NCBI 数据库检索 GAPDH 和
                Genome Atlas，CGGA）的mRNA⁃seq 数据集及对应的               HOXB4基因的mRNA序列，使用Primer⁃BLAST设计
                临床随访信息，分析胶质瘤患者肿瘤组织中HOXB4                          引物，并委托通用生物（安徽）股份有限公司合成引
                的表达，评估HOXB4表达水平与患者总体生存期的                          物。具体引物序列见表1。
                关系。                                                   使用 HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR

                1.2.2  细胞培养                                       试剂将胶质瘤细胞总RNA样品逆转录为cDNA。之
                    将胶质瘤细胞（U251、U373和U87）分别接种于                    后，按照说明书顺序分别加入 ddH2O、2×Taq Plus
                60 mm培养皿，添加10% FBS的DMEM完全培养基，                     Master Mix、引物和 cDNA，混匀后在 PCR 仪上进行

                培养环境为 5% CO2、37 ℃。待细胞密度达 80%~                     扩增反应。待PCR产物完全冷却，在1.5%的琼脂糖
                90%时，弃去旧培养基，用PBS洗涤，再加入1 mL胰                       凝胶进行 30 min 的 120 V 恒压电泳，并用凝胶成像
                酶消化。离心收集细胞沉淀，重悬后按实验所需比                            系统进行拍照。

                                                        表1 PCR引物序列
                                                  Table 1 Sequences of PCR primer
                       Gene                   Forward primer（5′→3′)                   Reverse primer（5′→3′)
                      GAPDH             CAAGGTCATCCATGACAACTTTG                   GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG
                      HOXB4             AGGTCTTGGAGCTGGAGAAGGAATT                 TTGGTGTTGGGCAACTTGTGGT

                1.2.4  Western blot                               GAGAAGGAATTTCA⁃3′）、shHOXB4⁃i3（5′⁃GCCA⁃
                    取细胞裂解液，先煮沸8 min，再4 ℃、12 000 g离                GATCAAGATCTGGTTCC⁃3′）。同时构建对照 shR⁃
                心3 min，取上清备用。根据蛋白分子量的不同，配制                        NA质粒（shCTR）。之后将shHOXB4⁃i1、shHOXB4⁃i2、
                10%或12%的SDS⁃PAGE凝胶。蛋白加样后依次进行                      shHOXB4⁃i3 和 shCTR 质粒分别转染 U87 细胞 48 h，
                以下操作：50 V电泳浓缩蛋白，120 V电泳分离蛋白，                      行RT⁃PCR和Western blot检测HOXB4的表达量，筛
                300 mA湿转2 h，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，用PBST                   选出沉默效率最高的靶点。
                洗涤，一抗4 ℃摇床孵育过夜；次日用PBST洗涤3次，                       1.2.7  质粒转染
                每次 10 min。随后室温孵育 HRP 标记的抗兔二抗                          胶质瘤细胞密度达 60%时进行转染，具体步骤
                30 min，再用PBST洗涤3次，每次10 min。最后均匀                   如下：取 2 个 EP 管，分别配制转染试剂溶液（3 μL
                滴加ECL化学发光试剂，在化学发光成像仪上检测。                          PolyFast Reagent+47 μL 无血清 DMEM）和质粒溶液
                1.2.5  HOXB4过表达质粒的构建                             （1 000 ng 质粒+无血清 DMEM 补至 50 μL），分别混
                    HOXB4过表达质粒（pIRES2⁃HOXB4）由通用生                  匀后静置 5 min。再将两者混合并轻柔吹打，静置
                物（安徽）股份有限公司构建并测序鉴定。通过菌                            15 min。弃去细胞旧培养基，PBS 洗涤 1 次，加入
                液复苏、扩增和质粒提取，获得pIRES2⁃HOXB4质粒                      900 μL无血清DMEM，随后将转染混合液均匀加入
                和 pIRES2⁃EGFP 空载质粒后，转染 U87 和 U251 细               培 养 皿 中 。 培 养 8 h 后 ，更 换 为 含 10% FBS 的
                胞，48 h 后用 RT⁃PCR 和 Western blot 检测相关基因            DMEM继续培养。
                的mRNA和蛋白水平。                                       1.2.8  CCK⁃8实验

                1.2.6  HOXB4干扰质粒的构建和靶点筛选                              将细胞接种于 96 孔板，待细胞密度到 60%时，
                    由南京科瑞斯生物科技有限公司设计3个针对                          进行质粒转染，培养 48 h 后加入 100 μL/孔的 10%
                HOXB4 基因的不同靶序列，并据此构建了 3 个                         CCK⁃8 溶液，37 ℃孵育 30 min，使用酶标仪检测
                HOXB4干扰质粒（HOXB4 shRNA，即shHOXB4），分                 450 nm处吸光度值。

                别命名为 shHOXB4⁃i1、shHOXB4⁃i2 和 shHOXB4⁃             1.2.9 Transwell实验
                i3。靶序列如下：shHOXB4⁃i1（5′⁃GGAATATTCA⁃                    Transwell 小室放置在24孔板中，Transwell 小室
                CAGAGCGATTA⁃3′）、shHOXB4⁃i2（5′⁃GGAGCTG⁃            下方加入 600 μL DMEM 完全培养基，上方添加
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