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第41卷第1期
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                  结直肠癌是世界上最常见的癌症之一，也是与                          20 μL MTT 溶液，继续孵育 4 h，终止培养。每孔加
                                        ［1］
              癌症相关死亡的第二大原因 。近年来，尽管发达                            150 μL DMSO 并振荡 10 min。在酶标仪 490 nm 波
              国家的结直肠癌发病率已开始下降，但发展中国家                            长处测定各孔吸光度值。细胞增殖抑制率=（1-实
                                                    ［2］
              的结直肠癌发病率仍保持急剧上升的态势 。外科                            验组吸光度/对照组吸光度）×100%。
              手术是目前结直肠癌的主要治疗手段，但术后往往                            1.2.3 克隆形成实验
              因发生转移或复发而影响预后               ［3-4］ 。远处转移是导              常规消化对数期细胞后，用含10％胎牛血清的
              致结直肠癌患者死亡的主要原因，肝脏是结直肠癌                            RPMI 1640培养液配制单细胞悬液，以每孔1 000个
                                   ［1］
              患者最常见的转移位点 。辅助放化疗可以降低术                            细胞密度接种到 6 孔板，每孔体积为 200 μL。贴壁
              后复发率和转移率、提高患者的长期生存率。伊立                            后，6 Gy X线照射（照射组）或预先用10 μg/mL浓度
              替康（CPT⁃11）是一种选择性拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，                        CPT⁃11 作用 24 h 后联合 6 Gy X 线照射（联合处理
              临床上广泛应用于肿瘤治疗，包括转移性结直肠癌                            组），继续培养 10 d 后，加入 5 mL 甲醇固定 10 min。

              复发患者以及恶化病例的治疗。有研究报道，CPT⁃                          加入适量 0.1% 结晶紫染色 15 min，在显微镜下计
              11 可抑制食管癌 EC109 细胞增殖并具有放射增敏                       数大于50个细胞的克隆数。计算公式为：克隆形成
              作用 ，而有关伊立替康联合 X 线的联合应用对人                          率=（克隆形成平均数/接种细胞数）×100%。实验重
                  ［5］
              结肠癌细胞系HCT⁃116的作用研究尚未曾报道，故                         复3次。
              本实验研究 CPT⁃11 对人结肠癌细胞系体外增殖以                        1.2.4 蛋白提取和全自动蛋白表达定量分析
              及放射敏感性的影响。                                             常规收集 3 组细胞，并用预冷 PBS 洗 1 遍，每瓶
                                                                细胞加入 200 μL RIPA 裂解液于冰上裂解 10 min。
              1  材料和方法
                                                                将裂解后的样品 12 000 g 离心 5 min，取上清，BCA
              1.1 材料                                            法测蛋白浓度。按照Wes 标准流程上机检测，终浓
                  HCT⁃116 细胞购自中国科学院上海细胞所，                       度为1 mg/mL。
              CPT⁃11、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐                        1.2.5 AO/EB实验
             （MTT）、普通 RIPA 裂解液和 AO 染色液均购自北京                          常规消化对数期细胞后，接种到 6 孔板。贴壁
              索莱宝科技有限公司，RPMI 1640 培养基和胎牛血                       后，6 Gy X线照射（照射组）或预先用10 μg/mL浓度
              清购自美国 Gibco 公司，兔抗 p53、p21 及内参 GAP⁃                CPT⁃11 作用 24 h 后联合 6 Gy X 线照射（联合处理
              DH 抗体购自美国Immunoway公司；CO2 恒温培养箱                    组）。继续培养24 h后，加入5 mL甲醇固定10 min。
              购自美国 Thermo Forma公司，酶标仪购自美国BIO⁃                   加入 AO/EB 工作液，室温避光染色 20 min，倒置荧
              RAD公司，全自动蛋白质印迹定量分析系统购自美                           光显微镜下计数并拍照。吖啶橙可透过正常细胞
              国Protein Simple 公司，荧光显微镜购自日本奥林巴                   膜，故细胞核呈绿色荧光；对于凋亡细胞，因染色质
              斯公司。                                              固缩或断裂形成凋亡小体，表现为黄绿色荧光。
              1.2  方法                                           1.3  统计学方法
              1.2.1 HCT⁃116细胞的体外培养及传代                                应用 SPSS 22.0 统计软件对数据进行统计分
                  HCT⁃116 细胞培养于含 10%灭活胎牛血清的                     析，计量资料用均数±标准差（x ± s）表示，多组比较
              RPMI 1640 培 养 基 中 ，加 入 100 U/mL 青 霉 素 和           采用单因素方差分析，两组细胞增殖率比较采用广
              100 μg/mL 链霉素，于 37 ℃、5% CO2 的饱和湿度培                义线性模型分析，以剂量作为自变量，试验组别作
              养箱中传代培养。用倒置显微镜观察细胞生长状                             为分组因素，剂量和组别的乘积作为交互因素，对
              况，每3 d传代 1 次，选对数生长期细胞进行实验。                        不同试验组别得到的两条直线的斜率进行比较，若
              1.2.2 MTT实验                                       交互项有统计学意义，说明自变量剂量对结果变量
                  常规消化对数期细胞后，用含10％胎牛血清的                         细胞增殖率的影响在不同组别中有差异。以 P＜
              RPMI 1640培养液配制单细胞悬液，以每孔2 000个                     0.05为差异有统计学意义。
              细胞密度接种到96孔板，每孔体积为200 μL。贴壁
                                                                2 结 果
              后，用不同浓度CPT⁃11（10、20、30、40、50 μg/mL）作
              用 24 h 或单次不同剂量 X 线（3、6、9、12、15 Gy）照               2.1 CPT⁃11对HCT⁃116细胞增殖的抑制作用
              射，每个剂量组3个复孔。继续培养48 h，每孔加入                              采用 MTT 法检测 10~50 μg/mL 的 CPT⁃11 作用
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