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第41卷第1期           马锦琪，李 鹰，黄建荣，等. 胎盘生长因子荧光免疫层析法检测的临床性能评估［J］.
                  2021年1月                   南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（01）：054-058，064                     · 55  ·


                    本研究建立了荧光免疫层析的PlGF检测方法，                        要求，对本项目建立的PlGF荧光免疫层析检测方法
                并对其分析性能与临床性能进行评价。                                 的分析性能进行评价，具体方法如下。
                                                                  1.2.2.1 空白限
                1  材料和方法
                                                                      用空白质控品重复测定10次，计算信号值的平
                1.1  材料                                           均值和标准差，得出平均值+2×标准差所对应的信
                    鼠抗人 PlGF 单抗（克隆号：P616）和羊抗人                     号值，代入定标曲线方程计算对应的浓度值，即为
                PlGF 多抗（货号：CSB⁃DA217）（无锡金泰格生物科                    空白限。
                技有限公司）；重组人 PlGF 蛋白（货号：TP723367，                   1.2.2.2 灵敏度（检出限）
                OriGene 公司，美国）；荧光微球（货号：FCEU002，规                      参照行业标准       ［11］ 的方法，具体如下：预设灵敏
                格：0.19 μm）（Bangs公司，美国）。对照试剂：胎盘生                   度（检出限）为10.0 pg/mL，配制5份低值样本（10.0~
                长 因 子 检 测 试 剂 盒（电 化 学 发 光 法 ，批 号 ：                20.0 pg/mL），每份样本检测5次，对检测结果按照大
                21906701，Roche公司，德国）。荧光分析仪（广州蓝                    小进行排序并与空白限进行比较，至少 2 份样本的
                勃生物科技有限公司，型号：AFS⁃1000）；化学发光                       浓度高于空白限，则预设10.0 pg/mL 即为PlGF 检测
                分析仪（Roche公司，德国）。                                  方法的灵敏度（检出限）。

                1.2  方法                                           1.2.2.3 准确度（回收率）
                1.2.1 反应体系的建立                                         将高浓度的PlGF样品A（11 045.0 pg/mL，10 μL）
                1.2.1.1 抗体标记条件                                    加入到空白质控品 B（100 μL）中；重复测试 3 次求
                    抗体标记按荧光微球说明书进行，每毫克微球标                         平均值，根据以下公式计算回收率：（R）=［C×（V0+
                记80~100 μg抗体。将微球与抗体（鼠抗人PlGF单抗）                    V）-C0×V0 ］/（V×Cs）×100%，式中 R 为回收率；V 为样
                混合于pH为5.0~7.5的5种MES缓冲液（0.1 mol/L）中，               品 A 液的体积；V0为样品 B 液的体积；C 为样品 B 液
                放置室温，200 r/min摇床上反应2 h后于13 000 r/min              加入A液后的检测浓度；C0为样品B液的浓度；Cs为
                4 ℃离心30 min，取上清液测定残余抗体的量。                         样品 A 液的浓度。参照行业标准              ［11］ 的要求，回收率
                1.2.1.2 标记抗体与包被抗体用量                               应在85%~115%。
                    线性范围预设：20.0~9 000.0 pg/mL，按照表 1               1.2.2.4 线性范围
                的棋盘法，设置不同的标记抗体以及包被抗体（羊                                参照行业标准       ［11］ 的方法，确立本项目PlGF荧光
                抗人 PlGF 多抗）用量；组装 PlGF 检测卡，采用 0~                   免疫层析检测方法的线性范围，具体方法如下：预
                10 000.0 pg/mL 的质控品进行检测，确立 PlGF 标记                设线性范围为20.0~9 000.0 pg/mL；将高浓度质控品
                抗体与包被抗体的最佳用量。                                    （9 354.0 pg/mL）稀释至5个浓度，最低浓度应接近线
                   表1 棋盘法选择最佳的标记抗体与包被抗体用量                         性范围下限（20.0 pg/mL），每个浓度重复检测3次，计
                Table 1  The optimal amounts of conjugated and coated  算平均值；计算检测浓度的均值与理论值的线性相
                        antibody selected by checkerboard method  关性，线性相关系数r应不低于0.990。
                 包被抗体                  标记抗体（μL/cm）                1.2.2.5 重复性
                （μg/μL）         5.0         2.5         1.0           浓度分别为 500.0、5 000.0 pg/mL 的 PlGF 质控
                 2.00          配方1         配方2         配方3        品各重复检测 10 次，计算 10 次测量结果的平均值
                 1.00          配方4         配方5         配方6
                                                                  和标准差，根据以下公式计算变异系数：CV（%）=标
                 0.50          配方7         配方8         配方9
                                                                  准差/平均值×100%。
                 0.25          配方10        配方11        配方12
                                                                  1.2.2.6 干扰试验
                1.2.1.3 反应时间                                          交叉反应（特异性）：取重组血管内皮生长因子
                    在确定上述参数的基础上，采用定值质控品                          （VEGF）和重组表皮生长因子（EGF），加入至空白质
               （500.0 pg/mL）摸索反应完成时间。                             控品及 PlGF 高值血清，终浓度分别为 200.0 ng/L 和
                1.2.2 分析性能评价                                      3.0 μg/L，重复测定3次计算均值。
                    参照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）                             干扰物质：取 PlGF 高值血清，分别加入不同浓
                EP06、EP15、EP07 文件   ［7- 9］ 和《WS/T 420⁃2013 临床     度的血红蛋白、总胆红素等可能的干扰物质，每个
                                                          ［10-11］
                实验室对商品化定量试剂盒分析性能的验证》                              样本分别重复检测3次，计算平均值及干扰率，干扰
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