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第41卷第10期
·1442 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年10月
色，镜下拍照。 因GAPDH。采用2 -ΔΔCt 计算目的基因表达的相对值。
1.2.5 细胞钙浓度测定 1.2.8 Western blot检测相关蛋白表达
将 12 孔板中培养的细胞用 PBS 清洗 3 次，每孔 使用 NE⁃PER 核蛋白⁃胞浆蛋白专用抽提试剂
加入 0.6 mol/L HCl 150 μL，4 ℃摇床 24 h 脱钙处 盒（Thermo公司，美国）按照说明书提取蛋白。提取
理。收集上清液，使用钙离子检测试剂盒测定钙浓 的蛋白用 10%~15%SDS⁃PAGE 电泳，上样量 50 μg，
度。每个样品取 5 μL 加入 96 孔板，加入 200 μL 工 半干转膜，用5%脱脂奶粉溶液的TBST缓冲液封闭，
作液，室温振荡5 min混合均匀，读取570 nm处吸光 一抗（BMP2、Runx2、Msx2、pSmad1/5）4 ℃孵育过夜，
度。分别测量标准品及样品在570 nm处吸光值（A 标、 二抗室温避光孵育 1 h，全程避光直接用 Odyssey ®
A 样）；继续加入 EDTA，在样品变为无色时立即再次 CLX imaging system（Li⁃cor Biosciences 公司，美国）
读取吸光值，得到 A 样/EDTA；计算细胞内绝对钙浓度 进行扫描。对扫描结果进行分析。
（mg/dL）=（A 标-A 样/EDTA ）/A 标。将 12 孔板中液体吸净 1.3 统计学方法
弃上清，预冷的 PBS 冲洗细胞；每孔加入 100 μL 通过 SPSS 23.0 软件进行分析，统计图通过
0.1 mol/L NaOH/0.1% SDS 裂解细胞，裂解液 4 ℃ Graphpad Prism 6.0 软件作图。所有计量数据以均
13 000 g 离心 20 min，取上清使用 BCA 法测蛋白浓 数±标准差（x ± s）表示，两组间比较采用t检验，多组
度。标准化钙浓度（μg/mg 蛋白）=绝对钙浓度/蛋白 间比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），
浓度。 Bonferroni法进行多重比较检验。P < 0.05表示差异
1.2.6 细胞ALP活性检测 有统计学意义。
将12孔板中培养液吸净，用预冷的PBS清洗；各
2 结 果
孔添加200 μL 0.05%的Triton X⁃100，反复冻融3次。
收集每孔中液体，4 ℃ 15 000 r/min离心15 min，取上 2.1 EGB761对AVIC活性的影响
清液作为待测样品。使用ALP活性检测试剂盒，向96 与正常对照组相比，0.1 mg/mL 和 0.3 mg/mL
孔板内添加20 μL待测样品和180 μL工作液，工作液 EGB761 干预组 AVIC 的活性无明显统计学差异
按每 200 μL 分析缓冲液加入 5 μL 醋酸镁和 2 μL （P＞0.05），而 0.5 mg/mL 和 0.7 mg/mL EGB761 干预
pNPP底物缓冲液的比例进行配制，轻轻震荡混匀。读 组与正常对照组相比，AVIC 活性均明显减低，差异
取 t0（0 min）和 t（4 min）时波长 405 nm 处的吸光值： 有统计学意义（P＜0.05），提示高浓度的 EGB761
ODt0、ODt及对照OD 校准和OD 水。根据公式计算待测样 可能具备致细胞毒性作用（图 1）。因此，本文选择
品的ALP活性（U/L）=［（ODt-ODt0 ）×200］/［（OD 标准-OD 水 ）× 0.1 mg/mL 和 0.3 mg/mL 两种浓度的 EGB761 进行后
200×4］×35.3。标准化细胞内ALP活性（U/mg蛋白）= 续研究。
细胞内绝对ALP活性/蛋白浓度。 2.2 EGB761对华法林诱导AVIC钙化的作用
1.2.7 Real⁃time PCR 茜素红染色结果显示，与正常对照组相比，
Runx2、Msx2 以及 BMP2 引物设计合成由美国 华法林处理组可见明显的橘红色矿化结节，给予
IDT 公 司 完 成 。 Runx2 上 游 引 物 5′ ⁃ GGACGAG⁃ 0.3 mg/mL 的EGB761干预处理后，橘红色矿化结节
GCAAGAGTTTCAC⁃ 3′，下游引物 5′⁃GTGGATTA⁃ 明显减少，而给予 0.1 mg/mL EGB761 干预处理后，
AAAGGACTTGGTGC⁃3′；Msx2上游引物5′⁃ CTGGT⁃ 橘红色矿化结节未见明显减少（图2A）。细胞内钙含
GAAGCCCTTCGAGAC⁃3′，下游引物 5′⁃AGGGCT⁃ 量测定结果显示，华法林处理组细胞内钙含量较正常
CATATGTCTTGGCG⁃3′；BMP2 上游引物5′⁃GGAGC⁃ 对照组显著升高（P < 0.05）。给予0.3 mg/mL EGB761
TAGCACTGAGCGAC ⁃ 3′ ，下 游 引 物 5′ ⁃ CGAAGT⁃ 干预处理后显著降低了细胞内钙含量（P < 0.05），而
GAGGAGCCCAAGTT ⁃ 3′）；GAPDH 上 游 引 物 5′ ⁃ 0.1 mg/mL EGB761 干预处理后，细胞内钙含量相比
GTCGGAGTGAACGGATTTGGC ⁃ 3′ ，下 游 引 物 5′ ⁃ 较华法林处理组未见明显差异（P＞0.05，图 2B）。
TM ALP 活性检测结果进一步显示，华法林显著增加了
CTTGCCGTGGGTGGAATCAT ⁃ 3′ 。 根 据 CellAmp
Direct TB Green RT⁃qPCR Kit（TaKaRa 公司，日本） ALP 活性，0.3 mg/mL EGB761 干预处理组与华法林
TM
说明书直接进行逆转录。使用 QuantStudio 7 Flex 处理组相比，细胞内 ALP 活性显著降低（P < 0.05），
Real⁃Time PCR仪进行实时荧光定量PCR。所有荧光 而0.1 mg/mL EGB761处理组与华法林处理组相比，
定量PCR反应均重复3次，目标基因标准化于管家基 细胞内 ALP 活性没有明显影响（P＞0.05，图 2C）。
