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第41卷第10期                  刘 静，孔祥清. 银杏叶提取物对瓣膜间质细胞钙化的保护作用［J］.
                 2021年10月                    南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（10）：1440-1446                      ·1441 ·


                发挥抑制凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的合成，从而起到                           Odyssey CLX imaging system（Li⁃cor Biosciences 公
                                                                         ®
                抗凝血的作用；另一方面，华法林还可以抑制维生                            司，美国）。
                素 K 依 赖 蛋 白 基 质 Gla 蛋 白（matrix Gla protein，       1.2  方法
                MGP）的羧基化。羧基化MGP通过直接抑制骨形态                          1.2.1 猪AVIC的分离和培养
                发 生 蛋 白（bone morphogenetic protein，BMP）2 和            取心脏放入含 5%双抗的预冷 PBS 溶液。沿主
                BMP4 的形成来防止钙化，是组织细胞钙化的重要                          动脉瓣环自根部约 20%处将主动脉瓣3个瓣叶从根
                抑制因子    ［5-6］ 。我们的前期研究已证实，治疗水平                    部剪下，放入预冷 PBS 中反复漂洗。将剪碎的主动
                10 μmol/L的华法林和1.6 mmol/L的无机磷酸盐（Pi）                脉瓣置入胶原酶Ⅱ消化液，37 ℃水浴搅拌消化 10~

                可导致主动脉瓣间质细胞（aortic valve interstitial             15 min，收集上清，加入10%胎牛血清的DMEM培养
                cell，AVIC）的钙化   ［7-8］ 。                           液，1 500 r/min 离心，去上清，加入高糖 DMEM 培养
                    大量的动物实验和临床研究表明，银杏叶提取                          液混悬沉淀；混匀液用一次性无菌细胞筛过滤后转
                物（ginkgo biloba extract，EGB761）对心血管疾病具            入 T25 细胞培养瓶中，37 ℃、5% CO2细胞培养箱继
                有保护作用，包括抗氧化清除超氧化物、自由基和                            续培养；48 h后观察细胞贴壁情况并进行首次细胞
                一氧化氮（nitric oxide，NO），抗血小板，减轻炎症和                  换液；72 h 后，细胞生长密度达到 80%融合时进行

                动脉粥样硬化斑块形成，调节包括NO和内皮素（en⁃                         细胞传代，即为原代培养的第 1 代。传代后取第
                dothelin，ET）在内的血管活性物质的合成，从而保护                     3~5 代的细胞用于本实验的后续研究。
                血管 。最近有研究表明，EGB761可显著减少β⁃甘                        1.2.2  华 法 林 诱 导 猪 AVIC 钙 化 模 型 的 构 建 及
                    ［8］
                油磷酸钠诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞内钙                             EGB761干预
                的 沉 积 ，从 而 减 轻 血 管 钙 化      ［10- 11］ ，但 尚 不 清 楚       高糖 DMEM 培养基中加入 1%的胎牛血清、1%
                EGB761是否可以减轻AVIC钙化。                               青链霉素双抗、1.6 mmol/L Pi 以及 10 μmol/L 华法
                    因此，本研究主要在猪 AVIC培养的基础上，                        林，4 ℃，避光保存待用。细胞贴壁融合达到 80%
                以治疗水平 10 μmol/L 的华法林和 1.6 mmol/L Pi诱              时，用华法林钙化培养基处理 AVIC，设为华法林处
                导钙化模型，观察EGB761对猪AVIC钙化及成骨分化                       理组。EGB761干预组在华法林诱导钙化培养基中同
                的作用及其机制。                                          时加入不同浓度的EGB761，共同孵育培养4~7 d。为
                                                                  了进一步验证 EGB761 抑制瓣膜间质细胞成骨样
                1  材料和方法
                                                                  分化的机制，设立 rhBMP2 干预组，将 100 ng/mL
                1.1  材料                                           rhBMP2 ［12］ 同时加入到华法林诱导钙化培养基和
                    3 月龄实验用猪，雌性，体重 20~30 kg，美国密                   EGB761中，共同孵育培养AVIC 4~7 d。
                西根州立大学动物实验中心提供。所有与动物有                             1.2.3 细胞活性检测
                关的工作都得到了美国密歇根州立大学实验动物                                 将 AVIC 以 8×10 个/100 μL 接种于 96 孔板中，
                                                                                     3
                伦理委员会的批准。高糖 DMEM 培养基（Gibco 公                      待细胞达到80%融合时吸去完全培养基；细胞分为
                司，美国）；华法林钠（Sigma⁃Aldrich 公司，美国）；重                 正常对照组、华法林处理组、不同浓度EGB761干预
                组人骨形态发生蛋白⁃2（human recombinant BMP2，               组（华法林诱导钙化培养基+0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL
                rhBMP2，广州赛业生物科技有限公司）；茜素红（Sig⁃                     EGB761），给予不同的培养基继续孵育细胞 4~7 d。
                ma⁃Aldrich 公司，美国）；CCK⁃8 试剂盒（Dojindo 公             按照 CCK⁃8 试剂盒说明，向每孔加入 10 μL CCK⁃8
                司，日本）；钙离子检测试剂盒（CA590，Randox公司，                    溶液，培养箱内孵育3 h，酶标仪测定450 nm处的吸
                英国）；BCA蛋白定量试剂盒（ThermoFisher 公司，美                  光度。
                国）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性检             1.2.4 茜素红染色
                测试剂盒（Bioassay Systems 公司，美国）；Msx2抗体、                  弃去培养板内培养基，用 PBS 清洗 3 次；4%甲
                pSmad1/5 抗体（Abcam 公司，美国）；Runx2 抗体、                醛溶液固定细胞 10 min，PBS 清洗 3 次；95%乙醇室

                BMP2 抗体、GAPDH 抗体（Cell Signaling Technology        温固定细胞20~30 min后，去离子水漂洗3遍；2%茜
                公司，美国）；Alex Fluro700 荧光标记二抗（Thermo⁃               素红染色 1 min，镜下观察到橘红色结节即终止染
                Fisher 公司，美国）；ABI QuantStudio 7 Flex Real⁃        色，最长染色时间不超过5 min；2%茜素红的配制方
                Time PCR System（Applied Biosystems 公司，美国）；        法参照Gao等     ［7-8］ 的方法；去离子水洗净非特异性染
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