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第41卷第10期
               ·1436 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年10月


                                                                                                         ［9］
              保持。退火后的 PCR 产物用 0.5 μL T7EN1 在 37 ℃               NLS放置在Cas9的一端        ［10-11］ ，有的放置在两端 ，有
              水浴锅中处理30 min，然后在2.5%的琼脂糖凝胶中                       的利用了不同的 NLS 序列          ［9，11］ ，密码子优化的规则
              电泳。利用 Image J 软件对凝胶电泳图片进行光密                       也各不相同      ［9-12］ 。我们将不同版本的 Cas9 和 PGL3⁃
                                                         ［9］
              度定量分析，采用之前报道的公式计算切割效率 ，                           U6⁃Rag1⁃sgRNA转染HEK293T细胞，利用T7EN1酶
                                  æ        a + b  ö             切来检测不同版本 Cas9 的切割效率。结果显示，
              公式如下：切割效率= ç1 - 1 -                ÷ ×100。a、b
                                  è       a + b + c  ø          NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS 和 Cas9⁃NLS 具有相对较高的切
              代表被切割片段的光密度值，c 代表未被切割片段                           割效率，光密度定量分析也得出一致的结果，但不

              的光密度值，对于需要 TA 克隆和测序的样品，PCR                        同Cas9版本之间的切割效率差异无统计学意义（图
              产物克隆进T载体，挑取阳性克隆用M13⁃47通用引                         1A、B）。我们选择 NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS 和 Cas9⁃NLS
              物测序。                                              这 2 个版本的 Cas9 进行 PiggyBac 转座子载体的构

                  PCR扩增引物hRAG1⁃For：5′⁃GTGAAAGCCAT⁃              建，通过连接IRES⁃hrGFP 来指示Cas9的表达情况，
              CACAGGGAGAC⁃3′，hRAG1⁃Rev：5′⁃AGAATGCCT⁃            通过连接 BleoR 抗性基因，利用 Zeocin 药筛来获得
              CCCAGCTCAAGC ⁃ 3′ ，扩 增 产 物 大 小 为 623 bp；          稳定插入 Cas9 的细胞（图 1C）。在瞬时共转染 PB⁃

              hERb lib⁃testF：5′⁃CTTCCTCCTACAACTGCAGTCAA⁃        TRE ⁃ NLS ⁃ Flag ⁃ Cas9 ⁃ NLS 和 PB ⁃ CAG ⁃ rtTA 的
              3′，hERb lib⁃testR：5′⁃CGCAATCGTGCCATTATACT⁃        HEK293T 细胞中加入 Dox，可以成功诱导 hrGFP 的
              CCA⁃3′，扩增产物大小为656 bp；hERRa lib⁃testF：5′⁃          表达，而未加入 Dox 的对照组中未见阳性信号（图
              GCATTGAGCCTCTCTACATCAAG⁃3′，hERRa lib⁃tes⁃         1D）。为了进一步检测Cas9是否表达，我们利用an⁃
              tR：5′⁃GGTACCCTGAACTCACTCACATC⁃3′，扩增产              ti⁃Flag抗体进行染色，结果显示GFP阳性的细胞，同
              物大小为 522 bp；hERRb lib⁃testF：5′⁃GACTTCCC⁃          时也是 Flag 阳性的，并且 Flag 信号定位在细胞核中
              GATTTGTGTCCACAG⁃3′，hERRb lib⁃testR：5′⁃CT⁃         （图 1E），说明 Cas9 蛋白成功表达和定位。有趣的
              GTCCAGTGCCAGAATGAGAAG⁃3′，扩增产物大小为                  是，Flag 染色结果显示 Cas9 蛋白在核仁中富集，这
                                                                                     ［7］
              609 bp；hERRg lib⁃testF：5′⁃CACTACAGGACAGAC⁃        和之前报道的现象一致 ，最近的研究表明，Cas9含
              GCTTCATT⁃3′，hERRg lib⁃testR：5′⁃CTCGTTAGCT⁃        有核仁定位信号，突变核仁定位信号会导致Cas9蛋
              TACACTGGCAGTA⁃3′，扩增产物大小为684 bp。                   白均匀分布在细胞核中，但是其切割效率也会随之
                                                                    ［13］
              1.2.5  顺铂耐药克隆 sgRNA 序列测定和目标基因                     降低 。
              验证                                                2.2  可诱导表达Cas9的稳定细胞系的构建和验证
                  顺铂耐药克隆 sgRNA 序列扩增引物为 pGL3 to                       为了提高转座效率，我们使用插入片段较小的
              PLKO Cla1 For：5′⁃CTCGACGGTATCGATCACGAG⁃           PB⁃TRE⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo 载体构建可诱
              AC⁃3′，U6 array seq Rev⁃new：5′⁃CTGCCATTTGTCT⁃      导表达 Cas9 的稳定细胞系。PiggyBac 转座子载体、
              CGAGGTCGAG⁃3′，扩增产物大小为 549 bp，利用                   PB⁃CAG⁃rtTA 和转座酶载体共电转，加入 Zeocin 传
              pGL3 to PLKO Cla1 For引物进行测序。VDR基因编                代3次之后，挑选圆形的单克隆接种到96孔细胞板
              辑位点扩增引物为 hVDR lib⁃testF：5′⁃GCTGAAG⁃               中继续培养，加入 Dox 之后，在荧光显微镜下挑选
              CAGGAGGATTACTTGA⁃3′，hVDR lib⁃testR：5′⁃GA⁃         GFP 阳性的克隆，共挑出 7 个 GFP 信号较强的克隆
              CACCAACACACAGATCCTCAA⁃3′，扩增产物大小为                  （1A、1G、2B、3G、5H、8E、10A）继续培养（图2A）。为
              717 bp，利用hVDR lib⁃testF引物进行测序。                    了挑选效率最高的细胞系，我们在这 7 个细胞株中

              1.3  统计学方法                                        电转了PGL3⁃U6⁃Rag1⁃sgRNA，PCR扩增目的片段并
                  实验数据利用GraphPad Prism 7.0统计分析，数                进行T7EN1酶切，结果显示8E克隆具有较高的切割
              据以均数±标准差（x ± s）表示，采用单因素方差分                        效果（图 2A）。为了进一步检测切割效率，我们将
              析，使用 Tukey 检验进行两组比较，P < 0.05 为差异                  PCR 产物进行了 TA 克隆并测序，在 17 个成功测序
              有统计学意义。                                           克隆中检测到 15 个克隆含有突变，效率高达 88.2%
                                                                （15/17），其中 76.5%（13/17）的克隆发生了碱基缺
              2  结 果
                                                                失，11.8%（2/17）的克隆同时发生了缺失和插入（图
              2.1  可诱导表达Cas9载体的构建和验证                            2B），这些结果说明我们成功构建了可诱导表达
                  来自不同实验室的 Cas9 载体各不相同，有的                       Cas9的稳定细胞系。
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