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第41卷第10期 陈红全，王建瑛. 利用可诱导表达Cas9的HeLa细胞系进行顺铂耐药性基因筛选［J］.
2021年10月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（10）：1432-1439，1452 ·1435 ·

（续表1）
名称 序列（5′-3′）
58GCNF atgCGTCTCaACCGATCCAGGCTGCGAGCTTGTgttttagagctagaaatagcaag
59NR0B1 atgCGTCTCaACCGCAGCGGTACAGGAGTGCCAgttttagagctagaaatagcaag
60NR0B1 atgCGTCTCaACCGGCCGTGCCTCGGGCGCTGCgttttagagctagaaatagcaag
61NR0B2 atgCGTCTCaACCGCAGCTGCCAGAAGGATGGCgttttagagctagaaatagcaag
62NR0B2 atgCGTCTCaACCGCACCGCAGCCAGGGAGGGCgttttagagctagaaatagcaag
63NR2E1 atgCGTCTCaACCGGCCACTTGCTTGCGGATGGgttttagagctagaaatagcaag
64NR2E1 atgCGTCTCaACCGCGGTGAAGAAGGCCGGCGCgttttagagctagaaatagcaag
65NR2E3 atgCGTCTCaACCGAGCCACCAGGGACTCCGGCgttttagagctagaaatagcaag
66NR2E3 atgCGTCTCaACCGGTTTCAGCTGTTATAAGGCgttttagagctagaaatagcaag
67NR1D1 atgCGTCTCaACCGGAGCCGTCATCACTCAGGCgttttagagctagaaatagcaag
68NR1D1 atgCGTCTCaACCGCTCCCATTATAGAAGGAGGgttttagagctagaaatagcaag
69NR1D2 atgCGTCTCaACCGGTCGCAGCTGTTCCTGGGCgttttagagctagaaatagcaag
70NR1D2 atgCGTCTCaACCGGGAATCCGTTCTCCTCTCTgttttagagctagaaatagcaag
71NR2F1 atgCGTCTCaACCGGCCCGAACCGGGCGGGCCCgttttagagctagaaatagcaag
72NR2F1 atgCGTCTCaACCGTCGATGGGACAGTTCCTGTgttttagagctagaaatagcaag
73NR2F2 atgCGTCTCaACCGCAGGGAAATATATCCGGACgttttagagctagaaatagcaag
74NR2F2 atgCGTCTCaACCGCCGAAGCGCGACGTGGGATgttttagagctagaaatagcaag
75NR2F6 atgCGTCTCaACCGAGGAGGCGGCCACGGCACCgttttagagctagaaatagcaag
76NR2F6 atgCGTCTCaACCGCGTCCGGCCGCCGCAGGGTgttttagagctagaaatagcaag
77RORA atgCGTCTCaACCGTCAGCGGCTCAGCCTCTCCgttttagagctagaaatagcaag
78RORA atgCGTCTCaACCGTGAAGTTCCGTCAGCCCGTgttttagagctagaaatagcaag
79RORB atgCGTCTCaACCGCTTCTGCACCTCAGCATACgttttagagctagaaatagcaag
80RORB atgCGTCTCaACCGTTGTAATAACCCTCAGACTgttttagagctagaaatagcaag
81RORg atgCGTCTCaACCGGCTCCGGCGGAAGAAGCCCgttttagagctagaaatagcaag
82RORg atgCGTCTCaACCGCGCCAGGCATTTCTGCAGGgttttagagctagaaatagcaag
83PXR atgCGTCTCaACCGCATGGTTCCAGCTTTCTTTgttttagagctagaaatagcaag
84PXR atgCGTCTCaACCGACATTGAAGTGATAGCCAGgttttagagctagaaatagcaag
85CAR atgCGTCTCaACCGCTTTGCTCGCCGCAATGCCgttttagagctagaaatagcaag
86CAR atgCGTCTCaACCGGTGCCCATGTGGCGGGTGTgttttagagctagaaatagcaag
87ERb atgCGTCTCaACCGGGCTTGTGGTCTGCCGACCgttttagagctagaaatagcaag
88ERb atgCGTCTCaACCGATGGACCACTAAAGGAGAAgttttagagctagaaatagcaag
89ERRa atgCGTCTCaACCGTGGCCTGGGAGGCAGCGAGgttttagagctagaaatagcaag
90ERRa atgCGTCTCaACCGAAGGCTTTGCAGGCCTCACgttttagagctagaaatagcaag
91ERRb atgCGTCTCaACCGAGCATGTACTCGCACTTGAgttttagagctagaaatagcaag
92ERRb atgCGTCTCaACCGCACACGAGGCACAGGCGCTgttttagagctagaaatagcaag
93ERRg atgCGTCTCaACCGGCATGGCATAGATCTTCTCgttttagagctagaaatagcaag
94ERRg atgCGTCTCaACCGATAACCACCAACTCTCGGTgttttagagctagaaatagcaag

HeLa8E 克隆细胞经扩增后加入 Dox，以诱导 Research 公司，美国）二抗和Hoechst 33258（Sigma公
Cas9 的表达和对目标基因的编辑。分别加入 0.3、 司，美国）加入PBS，并室温孵育细胞1 h，PBS 洗 3 次
0.9、1.5 μg/mL 顺铂处理细胞48 h，在对照细胞（未加 后用 Vectashield Mounting medium（Vector Laborato⁃
Dox）全部死亡之后，撤掉顺铂。由于0.3 μg/mL的顺 ries 公司，日本）进行封片。所有免疫荧光图片用
铂不能使对照细胞全部死亡，后续实验从0.9 μg/mL Olympus Flueview 1000 激光共聚焦显微镜拍摄。
和1.5 μg/mL两组中挑选单克隆进行。 1.2.4 T7EN1切割检测
1.2.3 免疫荧光染色 收集的细胞用裂解液（10 μmol/L Tris⁃HCl，
HEK293T 细胞培养在包被了多聚赖氨酸的盖 0.4 mol/L NaCl，2 μmol/L EDTA，1% SDS，100 μg/mL
玻片上，转染72 h之后，细胞直接用于拍照，或者用 Proteinase K）在 58 ℃水浴锅中消化过夜，用酚氯仿

4%的 PFA（paraformaldehyde）室温固定 15 min，PBS 抽提裂解物，然后用乙醇沉淀得到DNA。目的DNA
洗 2 次，用含 0.2% Triton 100 的 PBS 处理 5 min 以增 片段通过PCR 从基因组中扩增出，PCR 产物用PCR
加细胞膜的渗透性，然后用标准羊血清（武汉博士 cleanup kit（Axygen 公司，美国）纯化，吸取 200 ng 纯

德公司）室温封闭 30 min。用加抗⁃Flag M2（Sigma 化后的 PCR 产物，在 20 μL 的 1×NEBuffer 2（NEB 公
公司，美国）的封闭液室温孵育 2 h。PBS 洗 2 次后， 司，美国）体系中退火，退火程序为95 ℃ 5 min；95 ℃~

将cy3⁃conjugated⁃goat⁃抗⁃mouse IgG（Jackson Immuno⁃ 85 ℃，每秒降低1 ℃；85 ℃~25 ℃，每秒降0.1 ℃；4 ℃