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南京医科大学学报（自然科学版） 第41卷第10期
·1432 · Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences） 2021年10月

·基础医学·

利用可诱导表达Cas9的HeLa细胞系进行顺铂耐药性基因筛选

陈红全 ，王建瑛 2*
1，2
1 2
浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科，浙江 杭州 310016；南京医科大学生殖医学国家重点实验室，江苏 南京 211166

［摘 要］ 目的：利用 PiggyBac 转座子系统，构建可诱导表达 Cas9 的稳定 HeLa 细胞系，并针对人核受体基因构建 sgRNA 文
库，进行顺铂耐药性基因筛选。方法：构建PB⁃TRE⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo载体，与PB⁃CAG⁃rtTA以及转座酶载体一同电转
到HeLa 细胞中，通过药筛和挑选单克隆得到稳定细胞系；构建核受体基因sgRNA 病毒文库，并感染可诱导表达Cas9的HeLa
细胞系，筛选对顺铂具有抵抗性的克隆，并进行目的基因的测序鉴定。结果：挑选出可诱导表达Cas9的8E单克隆细胞株，在5
个基因位点上可以进行高效编辑；感染sgRNA文库之后，挑选顺铂耐药的克隆，并鉴定出大部分克隆含有VDR sgRNA，经测序
发现这些克隆中的VDR基因发生突变。结论：利用PiggyBac转座子系统，构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系，利用这
个细胞系可以在多位点进行高效基因编辑，并可用于高通量文库筛选顺铂耐药性基因。
［关键词］ CRISPR/Cas9；PiggyBac转座子；可诱导表达；文库筛选
［中图分类号］ R730.5 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007⁃4368（2021）10⁃1432⁃09
doi：10.7655/NYDXBNS20211002

Screening of cisplatin resistance genes in HeLa cell line with inducible expression of Cas9

1，2
CHEN Hongquan ，WANG Jianying 2*
1 Clinical Laboratory，Sir Runrun Shaw Hospital，School of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou 310016；State
2
Key Laboratory of Reproductive Medicine，Nanjing Medical University，Nanjing 211166，China

［Abstract］ Objective：Taking advantage of the PiggyBac transposon system to generate a stable HeLa cell line that can inducibly
express Cas9，and to construct a sgRNA library for human nuclear receptor genes to screen for cisplatin resistance genes. Methods：PB
⁃TRE⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo vector was constructed and transferred into HeLa cells together with PB⁃CAG⁃rtTA and the
transposase vectors. Stable cell lines were obtained by drug screening and picking up single clones. Constructed the sgRNA virus
library targeting nuclear receptor genes to infect the stable cell line，screened the clones resistant to cisplatin，and carried out the
sequencing and identification of the target genes. Results：Five gene loci were edited efficiently in the stable cell line. Clones resistant
to cisplatin were obtained after infection of sgRNA library，and most clones harbored VDR sgRNA and mutant VDR gene. Conclusion：
Using PiggyBac transposon system，stable HeLa cell line with inducible expression of Cas9 was successfully constructed. The cell line
can be used for efficient gene editing at multiple sites and high⁃throughput library screening for cisplatin resistance genes.
［Key words］ CRISPR/Cas9；PiggyBac transposon；inducible expression；library screening
［J Nanjing Med Univ，2021，41（10）：1432⁃1439，1452］

耐药性仍然是治愈癌症的主要限制因素，尽管 术（RNA interference，RNAi）曾被应用于肿瘤细胞耐
多种化疗药物早期对肿瘤的治疗效果很好，但随着 药基因的筛选，但由于 RNAi 不能完全抑制基因表
耐药性的产生，常导致癌症复发 ，对肿瘤细胞耐药 达，而且存在广泛的脱靶效应，影响对基因功能的
［1］
机制的研究有助于更好地治疗癌症。RNA 干扰技 判定。CRISPR⁃Cas9（clustered regularly interspaced
short palindromic repeats/Cas9）系统具有高效、便捷
［基金项目］ 南京医科大学自然科学基金（NMUB2019033）
等诸多优点，为肿瘤细胞耐药性分子机制的解析提
∗
通信作者（Corresponding author），E⁃mail：wangjianying@njmu.
［2］
edu.cn 供了强大的工具 。