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第41卷第10期            陈红全，王建瑛. 利用可诱导表达Cas9的HeLa细胞系进行顺铂耐药性基因筛选［J］.
                 2021年10月                  南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（10）：1432-1439，1452                   ·1433 ·


                    CRISPR⁃Cas 系统是细菌和古细菌在长期演化                     针对人RAG1基因的sgRNA表达载体通过寡聚核苷
                过程中形成的免疫防御系统，用以对抗入侵的病毒                            酸（oligo）在体外退火，利用 Bsa Ⅰ位点插入 pGL3⁃
                及外源核酸 。目前，对Ⅱ类CRISPR⁃Cas系统中来                       U6⁃sgRNA⁃PGK⁃Puro 载体（Addgene 公司，美国） ，
                                                                                                             ［7］
                          ［3］
                源于酿脓链球菌的 Streptococcus pyogenes Cas9（sp⁃          所用 oligo 序列为 hRag1⁃U6⁃Up：5′⁃CCGGTGTCT⁃
                Cas9）研究最为深入，Cas9蛋白作为核酸内切酶，在                       GCTTTGATGGACA⁃3′；hRag1⁃U6⁃Down：5′⁃AAACT⁃
                引导RNA 的指导下识别目标DNA 序列后激活Cas9                       GTCCATCAAAGCAGACA⁃3′。
                              ［4］
                蛋白的酶切活性 。正是由于这种靶向功能，CRIS⁃                             用于高通量构建 sgRNA 的表达载体 pGL3⁃U6⁃
                PR/Cas9 系统已被广泛应用于多物种的基因编辑、                        ccdB⁃PGK⁃Puro 改自 pGL3⁃U6⁃sgRNA⁃PGK⁃Puro 载
                基因调控、定位成像、细胞谱系追踪、高通量文库筛                           体。以 pGL3⁃U6⁃sgRNA⁃PGK⁃Puro 为模板，利用前
                选以及病毒检测等领域 。目前该系统还存在诸多                            向特异引物和共用反向引物扩增出 19N⁃sgRNA
                                     ［5］
                缺点，如Cas9表达载体过大，不容易被转染进细胞；                         backbone，通过 Esp3Ⅰ酶切位点，插入 pGL3⁃U6⁃
                                                    ［6］
                Cas9载体长时间表达，会增加脱靶的风险 。因此，                         ccdB⁃PGK⁃Puro 载体。用于构建sgRNA 文库的慢病
                有必要构建一个可诱导表达Cas9的稳定细胞系，用                          毒载体 pLKO.1⁃U6⁃ccdB⁃PGK⁃Puro 改自 pGL3⁃U6⁃
                以解决低效转染和因 Cas9 长时间表达而导致高脱                         ccdB⁃PGK⁃Puro。
                靶风险的问题。                                               针对47个核受体基因各设计2条sgRNA（表1）。
                    慢病毒常被用于稳定细胞系的构建，但是需要                          共用的反向引物为 T7 gRNA Esp3I Rev：5′ ⁃ TTA⁃
                包装病毒颗粒，费时费力，并存在感染的风险，本研                           CACCGTCTCGTTTATGCTTCCGGCTCGTATG⁃3′。
                究利用便捷的 PiggyBac 转座子系统，成功构建了可                          PiggyBac 转座子系统由刘澎涛教授惠赠                 ［8］ 。
                诱导表达 Cas9 的稳定 HeLa 细胞系，并证明在多个                     NLS ⁃ Flag ⁃ Cas9 ⁃ NLS 和 Cas9 ⁃ NLS 片 段 分 别 来 自
                位点可以高效切割基因组；同时，我们针对人核受                            pST1374⁃NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS和pST1374⁃Cas9⁃NLS，
                体基因，设计了对应的 sgRNA 文库，在这个细胞系                        IRES⁃hrGFP 片段扩增自 pShuttle⁃IRES⁃hrGFP（Agi⁃
                上进行了抗癌药物顺铂（Cisplatin）耐药性的筛选，                      lent Technologies 公司，美国），Sv40 Pro⁃BleoR⁃pA 片
                以期为顺铂耐药机制的解析打下基础。                                 段扩增自pcDNA3.1⁃Zeo载体，以上片段通过酶切位
                                                                  点克隆至 PiggyBac 表达载体中，构建 PB⁃TRE⁃NLS⁃
                1  材料和方法
                                                                  Flag⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo 和 PB⁃TRE⁃Cas9⁃
                1.1  材料                                           NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo载体。
                    HEK293T 和 HeLa 细胞购自美国模式培养物集                   1.2.2 细胞培养和转染
                存库（American Type Culture Collection，ATCC）；高糖          HEK293T 和 HeLa 细 胞 培 养 于 高 糖 DMEM，
                DMEM（HyClone公司，美国），胎牛血清（FBS）（Gem⁃                 10% FBS，1% 100×青链霉素中。
                ini 公司，美国），青链霉素（Gibco 公司，美国）；Lipo⁃                    HEK293T 细胞利用 Lipofectamine 2000 进行转
                fectamine 2000（Invitrogen 公司，美国）；强力霉素             染。在12孔板中，1 μg Cas9各载体和0.5 μg sgRNA
               （Sigma 公司，美国）；Zeocin（Invitrogen 公司，美国）；            载体被共转染到HEK293T中，72 h之后收集细胞用
                嘌呤霉素（Merck 公司，德国）；高保真酶 PrimeSTAR                  于下游分析。在 24 孔板中，0.5 μg PB⁃TRE⁃NLS⁃
                Max DNA Polymerase（TaKaRa 公司，日本）；限制性              Flag⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo 和0.25 μg PB⁃CAG⁃

                内切酶Bsa Ⅰ（NEB 公司，美国）；Esp3 Ⅰ（Fermentas              rtTA载体被共转染到HEK293T中，24 h之后加入强
                公司，立陶宛）；多聚赖氨酸（Sigma 公司，美国）；                       力霉素（Dox）至2 μg/mL，72 h之后用于表达分析。
                T7EN1（NEB 公司，美国）；T 载体（TaKaRa 公司，日                     HeLa细胞利用电转（BioRad Gene Pulser XL）转
                本）。                                               染。4 μg PB⁃TRE⁃Cas9⁃NLS⁃IRES⁃hrGFP⁃Zeo、2 μg

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                1.2  方法                                           PB⁃CAG⁃rtTA和2 μg转座酶载体被共电转到2×10 个
                1.2.1 质粒构建                                        HeLa细胞中，48 h之后，加入100 μg/mL Zeocin筛选
                    pST1374⁃NLS⁃Flag⁃Cas9、pST1374⁃NLS⁃Flag⁃       3 代，然后用于单克隆的生长和挑选。对于挑出来
                Cas9⁃NLS、pST1374⁃NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NP、pST1374⁃        的 稳 定 表 达 可 诱 导 Cas9 的 细 胞 株 ，电 转 2 μg
                Cas9⁃NLS 和 pST1374⁃Cas9⁃SP 改自 pST1374⁃NLS⁃        sgRNA 表达载体，24 h 后加入 Dox（2 μg/mL）和嘌
                                                 ［7］
                flag⁃linker⁃Cas9（Addgene 公司，美国） 。用于构建             呤霉素（1 μg/mL），72 h后收集细胞并提取DNA。
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