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第41卷第10期
               ·1438 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年10月


                  为了检测HeLa 8E细胞株在其他基因位点的基                       RXRb）和类固醇生成因子⁃1（nuclear receptor 5A1，
              因编辑效果，我们针对人ERb、ERRa、ERRb和ERRg                     NR5A1）sgRNA 各有 1 个克隆（图 3C），剩下 12 个克
              4 个基因设计相应的 sgRNA，并检测切割效率。传                        隆 sgRNA 位点显示乱峰，无法确定具体是哪个
              统的 sgRNA 表达载体构建依赖 oligo 的退火然后连                    sgRNA。为了进一步验证目标基因是否被编辑，我
              接到载体中，无法进行sgRNA表达载体的高通量构                          们对21个含有VDR sgRNA单克隆的VDR区域进行
              建，为了能在HeLa 8E细胞上进行高通量筛选，我们                        了测序，结果显示20个克隆的sgRNA识别区域发生
              将sgRNA识别序列设计在前向引物上，以sgRNA的                        了突变（图3D）。
              骨架为模板，和公共后向引物扩增出携带完整
                                                                3  讨    论
              sgRNA 序列的片段，利用二类限制性内切酶 Esp3Ⅰ
              和T4 DNA连接酶，通过边切边连的方式，可以高通                              本研究利用 PiggyBac 转座子系统，成功构建了
              量地构建 sgRNA 表达载体（图 2C）。我们利用这种                      可诱导表达 Cas9 的稳定 HeLa 细胞系，并证明在多
              方法一次性构建了 8 条 sgRNA 表达载体，针对每个                      个位点可以高效切割基因组。同时，我们针对人核

              基因，等质量混合 2 条 sgRNA 载体，并电转 HeLa 8E                 受体基因构建了sgRNA文库，在这个细胞系上进行
              细胞系，PCR 扩增结果显示每个基因都出现了明显                          了顺铂耐药性的筛选。之前有研究表明，PiggyBac
              的片段缺失（图 2D）。以上结果证明我们构建的可                          转座子在转座酶存在的情况下会发生再转座或者
              诱导表达 Cas9 的稳定细胞系没有编辑位点的偏好                         丢失的现象      ［16］ ，为了防止这种情况的出现，我们转
              性，可以在多个基因位点进行高效基因编辑，为下一                           座酶是瞬时表达的，不会持续性存在；同时，在培养
              步用于高通量sgRNA文库筛选打下了很好的基础。                          HeLa 8E 细胞株的过程中，也会定期加上 Zeocin 进
              2.3  顺铂耐药性核受体基因的筛选                                行药筛，以排除Cas9丢失和被沉默的可能。除了通
                                                                                                           ［7］
                  顺铂是一种含铂的抗癌药物，对恶性上皮肿                           过诱导控制 Cas9 的表达，Cas9 切口酶/双 sgRNA 、
              瘤、淋巴瘤等都有治疗功效，长期使用这种药物会导                           截短 sgRNA   ［17］ 、高保真 Cas9 突变体  ［18-23］ 等策略也用
              致人体产生耐药性，但是耐药机制仍存在争议 。核                           于降低CRISPR/Cas9的脱靶效应。另外，多个比sp⁃
                                                      ［1］
              受体超家族是配体激活的转录因子，共含有48个基                           Cas9小的同系物如saCas9       ［24］ 、Cpf1 ［25］ 等也被发现，一
              因，在细胞分化、增殖和代谢中发挥不同作用，参与                           定程度上解决了转导效率低的问题。关于 Cas9 在
              多种癌症的发生、发展          ［14］ 。核受体是重要的药物靶              核仁中富集，之前的研究表明，一旦表达 sgRNA，
              点，阻断乳腺癌患者雌激素受体（ERa）作用的药物                          Cas9 会均匀分布在细胞核中 ，这种现象是很难用
                                                                                          ［7］
              或阻断前列腺癌患者雄激素受体（AR）作用的药物                           Cas9 含有核仁定位信号来解释的              ［13］ ，可能是由于
              显著改善了患者的生存，但也伴随着严重的药物耐                            Cas9/sgRNA复合体的溶解性更好，亦有可能是其他
              药性  ［14］ 。为了探究核受体超家族成员是否参与顺                       机制导致，值得进一步的研究。
              铂耐药性的发生，我们针对目前鉴定的47个人类核                                之前有文章报道核受体基因 ERb 的激动剂可
                                                ［15］                                                   ［14］
              受体基因（由于 HeLa 细胞不表达 ERa              ，所以排除         以调节胶质母细胞瘤细胞对顺铂的敏感性                       ，鼓励
              此基因），设计了 94 条 sgRNA，组成了一个小型的                      我们去探究核受体超家族成员与顺铂耐药性的关
              sgRNA 文库（图 3A），包装成病毒颗粒之后感染                        系。在筛选的过程中，由于含有 RARb、RXRb 和
              HeLa 8E 细胞，利用嘌呤霉素筛选整合进 sgRNA 载                    NR5A1 sgRNA的克隆较少，我们没有进一步去验证
              体的细胞。在开始顺铂耐药性实验前 48 h，加入                          对应的基因是否被编辑，以及有12个克隆含有多个
              Dox以诱导Cas9的表达和对目标基因的编辑。我们                         sgRNA，也没有进一步去验证具体是哪些基因被编
              设计了 3 个顺铂浓度梯度，在对照细胞全部死亡之                          辑，这些都值得继续探索。20 个含有 VDR sgRNA
              后，撤掉顺铂。从 0.9 μg/mL 和 1.5 μg/mL 两组中共               克隆的测序结果显示，所有单克隆都携带相同的突
              长出 37 个单克隆（图 3B），挑选每个单克隆并扩增                       变，提示这 20 个单克隆可能来源于同一个细胞，之
              培养，提取基因组DNA之后PCR扩增包含sgRNA的                        前有文章报道维生素D3及其受体VDR调控机体的

              序列，Sanger 测序结果发现 21 个克隆含有维生素 D                    钙磷代谢稳态，对多种肿瘤细胞的增殖有抑制作
              受体（vitamin D3 receptor，VDR）sgRNA，2 个克隆含           用。因此，突变VDR 可能会使HeLa 8E细胞的增殖
              有维甲酸受体β（retinoic acid receptor beta，RARb）         加快，导致长出的克隆大部分含有VDR突变，当然，
              sgRNA，含有视黄醇 X 受体（retinoid x receptor beta，        这也可能是顺铂耐药性发生的原因，需要进一步通
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