Page 19 - 第10期

第41卷第10期 陈红全，王建瑛. 利用可诱导表达Cas9的HeLa细胞系进行顺铂耐药性基因筛选［J］.
2021年10月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（10）：1432-1439，1452 ·1437 ·

A B 15 D hrGFP Merge
NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS
NLS⁃Flag⁃Cas9 NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NP （ % ） 10
Cas9⁃NLS
（bp） Cas9⁃SP Ctrl
2 000- 切割效率 5
1 000- -Dox
750-
500-
0
250-
NLS⁃Flag⁃Cas9
NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NP
NLS⁃Flag⁃Cas9⁃NLS
100- Cas9⁃NLS Cas9⁃SP
C
NLS⁃Flag⁃ IRES⁃
3LTR TRE pA pA BleoR Sv40 Pro 5LTR +Dox
Cas9⁃NLS hrGFP
IRES⁃
3LTR TRE Cas9⁃NLS pA pA BleoR Sv40 Pro 5LTR
hrGFP
E
Flag hrGFP Hoechst Merge

A：不同版本Cas9在RAG1基因上的切割效率；B：对A图的光密度定量分析，数据以平均值±标准差呈现（n=3），组间差异无统计学意义；
C：载体构建示意图；D：HEK293T细胞中，转座子载体在Dox诱导下的GFP表达情况（×200），标尺：100 μm；E：PFA固定过的HEK293T细胞中，
Cas9和GFP的表达情况（×1 800），标尺：10 μm。
图1 可诱导表达Cas9载体的构建和验证
Figure 1 Construction and verification of inducible Cas9 expression vector

A （bp） B
2 000- GCTTTGGTGTCTGCTTTGATGGACATGGAAGAA （ref）
1 000- 1A 1G 2B 3G 5H 8E 10A GCTTTGGTGTCTGCTTTGATGGACATGGAAGAA （WT，x2）
750- GCTTTGGTGTCTGCTTTGATG∶ACATGGAAGAA （-1，x6）
500- GCTTTGGTGTCTGCTTTGAT∶∶ACATGGAAGAA （-2）
GCTTTGGTGTCTGCTTTGA∶∶∶ACATGGAAGAA （-3）
250- GCTTTGGTGTCTGCTTTGA∶∶∶∶CATGGAAGAA （-4）
GCTTTGGTGTCTGCTTT∶∶t∶∶ACATGGAAGAA （-5，+1）
100- GCTTTGGTGTCTGCTTTGATG∶∶∶∶∶∶GAAGAA （-6）
GCTTTGGTGTCTGCTTTG∶∶∶∶∶∶ATGGAAGAA （-6）
GCTTTGG∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶GACATGGAAGAA （-14）
G∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶∶GAA （-29）
GCTTTGGTGTCTGCTTTGATG∶∶CATGGAAGAA （-2，+11）
tttgcttcttc
C D
Esp3l （bp） ERb ERRa ERRb ERRg
2 000-
ACCGgGAGACG CGTCTCcTAAATTCT
U6 ccdB R1 R2 Ctrl R1 R2 Ctrl R1 R2 Ctrl R1 R2 Ctrl
TGGCcCTCTGC GCAGAGgATTTAAGA 1 000-
750-
Esp3l
500-
Esp3l
250-
atgCGTCTCaTAAA TAAAcGAGACGgtg
19N sgRNA backbone
tacGCAGAGtATTT ATTTgCTCTGCcac
100-
Esp3l
A：7株单克隆细胞在RAG1基因上的切割效率；B：8E克隆中，RAG1⁃sgRNA切割效果的TA克隆测序结果。PAM（protospacer adjacent mo⁃
tif）序列用绿色加下划线表示；sgRNA作用靶点用红色表示；突变处用蓝色加小写字母表示；-代表碱基缺失，+代表碱基插入；×n代表TA克隆
数；C：高通量构建sgRNA载体示意图，箭型代表Esp3Ⅰ内切酶的识别位点，蓝色虚线代表内切酶切割位点，19N代表sgRNA识别位点；D：针对
每个基因设计2条sgRNA，共同电转8E细胞株，PCR扩增之后可以检测到片段缺失，R1和R2代表重复2次。
图2 可诱导表达Cas9的稳定细胞系的构建和验证
Figure 2 Generation and verification of a stable HeLa cell line with inducible expression of Cas9