Page 30 - 第10期
P. 30

第41卷第10期
               ·1448 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年10月


                  肝脏缺血再灌注（ischemia⁃reperfusion，IR）损伤            后，取小鼠腹部正中切口，用生理盐水棉签明确分
              是肝部分切除术和肝移植术后常见的并发症，其发                            离肝左、中叶后，使用无损伤血管夹夹闭通往肝左
              病机制复杂。该过程涉及到活性氧的释放，炎症细胞                           叶和肝中叶的肝蒂，此时可见缺血肝叶色泽改变，
                                               ［1］
              的激活，炎性介质的产生等诸多因素 。近年来的                            关腹。90 min 后，松开血管夹，缺血肝叶恢复血供，
              研究发现内质网应激（endoplasmic reticulum stress，           肝脏颜色转红，关腹。6 h 后处死小鼠，收取静脉血
              ERS）反应能加重炎症反应，是导致肝脏缺血再灌注                          和肝脏组织，部分组织用4%甲醛固定，其余肝脏样
              损伤的重要病理机制之一 。STF⁃083010 是肌醇依                      本生理盐水冲洗后，液氮保存。
                                     ［2］
              赖酶 1（inositol⁃requiring enzyme 1，IRE1）核糖核酸        1.2.2 RNA提取和实时定量PCR
              酶特定抑制剂，可特异性阻断 IRE1⁃剪切型 X⁃盒                             采用 TRIzol 法提取组织和细胞 RNA，并测定
              结合蛋白 1（spliced X⁃box binding protein 1，sXBP1）     RNA 的浓度及纯度（NanoDrop 公司，美国）。首先
              信号通路，有效降低 sXBP1 的表达              ［3］ 。本研究旨        按照反转录试剂盒说明书进行逆转录，所得 cDNA
              在探讨 STF⁃083010 预处理对肝脏缺血再灌注损                       进行实时定量 PCR，反应使用 SYBR qPCR Master
              伤的影响。                                             Mix 试剂，并在 ABI 7900 Fast Real⁃Time PCR system

                                                                上进行。按照 2       -ΔΔCt  法来计算相对表达量，实验重
              1  材料和方法
                                                                复 3 次。
              1.1  材料                                           1.2.3 蛋白提取及Western blot
                  30 只健康雄性 C57BL/6 小鼠，6~8 周龄，体重                      提取总蛋白时，使用含1％蛋白酶抑制剂和1％
              15~20 g，购自南京医科大学实验动物中心，无特殊                        磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解细胞。测定浓度
              病原体（SPF）环境下饲养，自由进食、饮水。动物实                         后，按比例加入 5×上样缓冲液，100 ℃水浴 10 min。
              验已获得动物伦理委员会的批准。STF⁃083010                         蛋白经 SDS⁃PAGE 电泳分离后，将相应分子量的蛋
             （Selleck 公司，美国）；丙氨酸氨基转移酶（alanine                   白湿转至 PVDF 膜上，然后在室温下用快速封闭液
              aminotransferase，ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶                  封闭10 min；分别加入一抗4 ℃孵育过夜，室温下二
             （aspartate aminotransferase，AST）检测试剂盒（北京           抗孵育 2 h，TBST 洗膜后使用超敏 ECL 曝光液成像
              达科为）；TRIzol（南京诺唯赞）、肿瘤坏死因子（tu⁃                     分析，实验重复3次。
              mor necrosis factor，TNF）⁃α、白细胞介素（interleu⁃        1.2.4 肝功能检测
              kin，IL）⁃6和IL⁃1β引物（Invitrogen公司，英国）；逆转                  取小鼠静脉血，3 000 r/min 离心 10 min，收集
              录 试 剂 盒（TaKaRa 公 司 ，日 本）；ChamQ 通 用 型              上清。根据试剂盒说明测定血清ALT和AST水平。
              SYBR Green qPCR Master Mix（南京诺唯赞）；TUNEL           1.2.5 肝脏组织病理学检查
              染色试剂盒（武汉赛维尔）；RIPA 裂解液（上海碧云                             取 10%福尔马林溶液固定的肝组织，常规切片
              天）；sXBP⁃1抗体（Proteintech公司，美国）、转录因子                后，HE 染色，于光镜下观察肝小叶结构、肝细胞水
              C/EBP 同源蛋白（C/EBP⁃homologous protein，CHOP）         肿及坏死的情况。
              抗体、GAPDH 抗体、兔源性二抗（CST 公司，美国）；                     1.2.6 TUNEL染色观察细胞凋亡情况
              超敏ECL发光液（苏州新赛美）。                                       根据TUNEL染色试剂盒说明操作，具体步骤为：
              1.2  方法                                           用免疫染色固定液4%多聚甲醛固定细胞30~60 min；
              1.2.1 动物模型                                        PBS洗涤2次，每次 10 min；加入免疫染色强力通透
                  将30只小鼠随机分成3组，每组10只。①假手                        液室温孵育 5 min；PBS洗涤2次，每次10 min；在样品
              术组（sham 组）：小鼠仅接受腹腔麻醉和开、关腹操                        上加 50 μL TUNEL 检测液，37 ℃避光孵育 60 min；
              作；②肝缺血再灌注组（IR 组）：小鼠在建立 IR 前                       PBS洗涤3次；用抗荧光淬灭封片液封片后，于荧光

              30 min，按 30 mg/kg 腹腔注射生理盐水；③ STF ⁃                显微镜下观察并拍照。
              083010 预处理+肝缺血再灌注组（IR+STF⁃083010                  1.3  统计学方法
              组）：小鼠在建立 IR 前 30 min，按 30 mg/kg 腹腔注射                   应用 GraphPad7.0 软件对实验数据进行统计学
              STF⁃083010。                                       处理。所有定量数据以均数±标准差（x ± s）表示，多
                  肝脏缺血再灌注模型建立具体步骤：小鼠术前                          组间差异采用方差分析，组间差异两两比较采用
              12 h禁食，不禁饮，5%水合氯醛腹腔注射，麻醉成功                        SNK 法。P < 0.05为差异有统计学意义。
   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35