Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第12期
·1730 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年12月
PS+1%生物素/泛酸+1 μg/mL insulin,分化培养基每 定量实验各组数据以均数±标准差(x ± s)表示。使
2 d换1次液,在诱导之后6~8 d细胞分化成熟,出现 用独立样本 t 检验分析两组数据之间的差异性,使
明显的脂滴后进行后续的其他实验。 用 one way ANOVA 分析多组数据之间的差异性。
BAC 褐色脂肪前体细胞使用生长培养基进行 P < 0.05为差异有统计学意义。
普通传代培养:DMEM+10%FBS+1%PS,细胞生长至
2 结 果
70%左右进行传代。将要分化的BAC细胞铺板后换
为分化培养基:DMEM+10%FBS+1%PS+0.1 μg/mL 2.1 miR⁃190在衰老褐色脂肪组织与白色脂肪组织
insulin+1 nmol/L三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine, 中的表达
T3),待其生长至90%及以上用诱导培养基进行诱导: Sirtuins蛋白家族又被称为长寿蛋白家族,其中
DMEM+10%FBS+1%PS+0.1 μg/mL insulin+1 nmol/L SIRT3 主要定位于线粒体,并被报道具有拮抗人干
T3+500 μmol/L IBMX+5 μmol/L Dex+0.125 mmol/L 细胞衰老的作用。相关研究表明,SIRT3 与衰老呈
Indo。将 BAC 细胞在诱导培养基中保持48 h以上, 现负相关性 [12] 。随着小鼠月龄的增加,小鼠iBAT与
然后换为分化培养基,分化培养基每2 d换1次液,在 iWAT中SIRT3的表达水平逐渐下降,证明了衰老进
诱导之后 6~8 d细胞分化成熟,然后每天换新鲜分化 程的发展(图 1A、B)。为了进一步确定 miR⁃190 与
培养基,出现明显脂滴后进行后续其他实验。 衰老之间的相关性,我们分别比较了不同年龄段小
1.2.5 细胞衰老模型构建 鼠 iBAT 与 iWAT 中 miR⁃190 的表达水平。RT⁃PCR
利用H2O2与棕榈酸(palmitic acid,PA)在体外构 的结果显示,iBAT 与 iWAT 中,随着衰老进程的发
建细胞衰老模型。在 3T3L1 白色脂肪前体细胞和 展,miR⁃190 的表达水平呈现逐渐上升的趋势(图
BAC褐色脂肪前体细胞出现明显脂滴后,进行诱导 1C、D),提示 miR⁃190 的表达水平与衰老呈现正相
衰老处理:分别配制用培养基稀释的 100 μmol/L 的 关性。众所周知,褐色脂肪组织是一种“燃烧脂
H2O2溶液和200 μmol/L的PA溶液,随后将配制好的 肪”,可以产生热量。有意思的是,miR⁃190 在褐色
溶液加入模型组细胞 24 h 孵育。吸去含有 H2O2和 脂肪组织中的表达水平最高,而在内脏白色脂肪组
PA的培养基,收取细胞样品。 织(eWAT)中表达最低,说明miR⁃190的表达可能与
1.2.6 荧光素酶报告基因实验 脂肪组织的产热有关(图1E)。
将处于生长对数期的 HEK 293T 细胞进行铺 2.2 miR⁃190在体外衰老脂肪细胞中的表达
板,细胞增殖至 80%左右进行转染,报告基因质粒 此外,利用 H2O2与 PA 在体外构建细胞衰老模
转染24~48 h后取出细胞板终止培养。根据试剂盒 型 [13] ,以验证上述体内实验的结果。图 2A~D 证明
操作说明进行后续实验。 了体外细胞衰老模型的构建成功。RT⁃PCR 的结果
1.2.7 定量PCR 显示,无论是在褐色脂肪细胞(BAC)还是白色脂肪
采用 TRIzol 试剂(Invitrogen 公司,美国)按操作 细胞(3T3L1)中,H2O2 和 PA 均可以使脂肪细胞中
说明书提取脂肪组织和细胞中的总 RNA。根据试 miR⁃190 水平升高,这与体内结果也是吻合的(图
剂盒操作说明进行后续实验。 2E~H)。
1.2.8 蛋白质免疫印迹 [11] 2.3 miR⁃190抑制脂肪细胞产热基因的表达
小鼠组织及细胞在匀浆后 10 000 r/min 离心 由于脂肪组织衰老会引起脂肪组织产热基因
20 min 得到上清。使用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度 表达的降低,我们首先检测了衰老细胞模型和衰老
作为内参,在保证蛋白量一致的情况下确定组织上 小鼠中产热相关基因 PR 结构域蛋白 16(PR domain
清液体积。在组织上清液中加入5×上样缓冲液(5× containing 16,PRDM16)的 mRNA 表达。结果显示,
loading buffer)后 100 ℃加热 10 min,即可获得组织 PRDM16的mRNA表达水平在两种衰老细胞模型中
样品。用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,待条带 均显著下降(图 3A、B)。在衰老小鼠的 iBAT 与
跑开后转膜,用 5%TBST 牛奶封闭 1 h,分别加入内 iWAT中也得到了相似的结果(图3C、D)。接着向褐
参和相应的一抗进行孵育,TBST充分洗涤后再加入 色 脂 肪 细 胞 与 白 色 脂 肪 细 胞 中 转 染 miR ⁃ 190
二抗进行孵育,TBST充分洗涤后上机检测。 agomir,并进行RT⁃PCR。结果显示,miR⁃190的过表
1.3 统计学方法 达会显著降低褐色脂肪细胞中产热相关基因解耦
数据用 GraphPad5.0 进行分析,除特别标注外, 联蛋白 1(uncoupling protein 1,UCP1)、PRDM16、细