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第41卷第12期 彭丹丹，李 言. MicroRNA⁃190调控衰老相关的脂肪能量代谢稳态［J］.
2021年12月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（12）：1728-1734 ·1729 ·
分子机制并寻找潜在的干预靶点迫在眉睫 ［7-8］ 。研 （Thermo Fisher 公司，美国）；RNA 抽提试剂 TRIzol、
究发现衰老会导致脂肪组织中 microRNA 的水平发 转染试剂 lipofectamine2000、DMEM、非必需氨基酸
［9］
生改变，从而影响能量代谢稳态 。miR⁃190⁃5p （non⁃essential amino acids，NEAA）、glutamine、0.25%
（miR⁃190）位于染色体15q22.2的 TLN2基因内含子 胰酶（trypsin）、胎牛血清及其他细胞培养试剂（Life
区。最近，越来越多的相关研究表明其与人类疾病之 technologies 公司，美国）；荧光素酶报告基因试剂盒
［10］
间具有相关性，尤其是在癌症的发生和发展方面 。 （Promega公司，美国）。
已知 miR⁃190 在多个组织中存在表达，但是其在脂 1.2 方法
肪组织中以及衰老进程中发挥的具体作用和分子 1.2.1 小鼠实验
机制仍不明确 ［10］ 。本研究对miR⁃190在脂肪细胞中 小鼠麻醉取血后处死，迅速收集褐色脂肪组织
的作用进行探究，鉴定衰老过程中miR⁃190水平的改 （intrascapular brown adipose tissue，iBAT）与皮下白
变及其在衰老相关代谢稳态失衡中的作用，探讨miR 色脂肪组织（inguinal white adipose tissue，iWAT）于
⁃190调控脂肪组织能量代谢稳态的分子机制。 液氮中速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱，待进一步
检测。体内miR⁃190 antagomir抑制剂作用通过定点
1 材料和方法
注射iBAT与iWAT部位进行。
1.1 材料 1.2.2 代谢笼
小鼠模型：实验所用小鼠 C57BL/6J（上海斯莱 将待检测的小鼠称量体重后每只单独放入检
克实验动物公司），均为年龄 4~8 周龄的雄鼠，待其 测小室，提供充足的粮食和饮用水后密封。启动自
成年后进行实验。动物20~22 ℃恒温饲养于无特定 动化小鼠新陈代谢监测系统，录入小鼠体重后开始
病原体（specific pathogen free，SPF）级动物房，每12 h 检测。
开关照明昼夜循环，以正常饲料饲养。本研究所有 1.2.3 HE染色
小鼠实验均严格遵循动物实验“3R”原则，按照中华 新鲜组织用 8%多聚甲醛固定 24~48 h 后脱水，
人民共和国国家标准《实验动物福利伦理审查指 石蜡包埋；修石蜡块、切片、展片、贴片、烤片（55~
南》（GB/T27416⁃2014）执行。 60 ℃）3~10 h；将切片依次放入二甲苯中 10 min
细胞系：褐色脂肪前体细胞（brown adipose cell， （2 次）、无水乙醇中5 min（2次）、95%乙醇中5 min、
BAC）细胞系，细胞培养基：改良杜氏伊格尔培养基 80%乙醇中片刻、70%乙醇中片刻脱蜡，后双蒸水洗
（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）+ 5 min；将切片用苏木素染液染色 5 min 后双蒸水洗
10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）+1%青链霉素 片刻；将切片用0.5%盐酸酒精分色约10 s，自来水洗
混合液（penicillin⁃streptomycin solution，PS）。3T3 L1 返蓝（约20 min）；将切片置于70%乙醇中5 min、80%
细胞系，脂肪前体细胞，细胞培养基：DMEM+10% 乙醇中5 min，然后用伊红染液（95%乙醇配制）染色
新生牛血清（newborn calf serum，NCS）+1%PS+生物 约 20 s；将切片依次置于95%乙醇中5 min、无水乙醇
素（8 mg/L）+ 泛 酸（17 μmol/L）。 所 有 细 胞 置 于 中5 min、二甲苯+乙醇（1∶1）中 5 min 和二甲苯
37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养，每天观测 中 5 min（2 次）；中性树胶封片，正置显微镜观察拍
细胞生长状态。 摄照片。
泛酸酯、生物素、3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄嘌呤（3⁃iso⁃ 1.2.4 细胞培养、诱导及分化
butyl⁃1⁃methylxanthine，IBMX）、地塞米松（dexameth⁃ 3T3L1脂肪前体细胞使用生长培养基进行普通
asone，Dex）、吲哚美辛（indometacin，Indo）和葡萄糖 传代培养：DMEM+10%NCS+1% PS+1%生物素/泛酸
（D⁃glucose）（Sigma 公司，美国）；核糖核酸（ribonu⁃ 酯，细胞生长至70%左右进行传代（生长过密后传代
cleic acid，RNA）反转录试剂盒、克隆用聚合酶链式 会影响之后的细胞分化效率）。需要分化的细胞铺板
反应（polymerase chain reaction，PCR）酶 LA Taq（Ta⁃ 生长接触抑制后继续在生长培养基中维持48 h左右
KaRa 公司，日本）；蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂、 （克隆增殖期），用诱导培养基对该状态下的3T3L1细
SYBR GREEN实时定量PCR试剂盒（Roche公司，瑞 胞进行诱导：DMEM+10%FBS+1%PS+1%生物素/泛
士）；蛋白定量试剂 Bradford、蛋白 marker PageRuler 酸 + 1 μg/mL insulin + 500 μmol/L IBMX + 1 μmol/L
Prestained Protein Ladde 和蛋白免疫印迹化学发光 Dex。此时3T3L1 细胞需在诱导培养基中至少保持
试 剂 Super West Pico Chemiluminescent Substrate 48 h，然后换为分化培养基：DMEM+10%FBS+1%
