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第41卷第12期 彭丹丹,李 言. MicroRNA⁃190调控衰老相关的脂肪能量代谢稳态[J].
2021年12月 南京医科大学学报(自然科学版),2021,41(12):1728-1734 ·1729 ·
分子机制并寻找潜在的干预靶点迫在眉睫 [7-8] 。研 (Thermo Fisher 公司,美国);RNA 抽提试剂 TRIzol、
究发现衰老会导致脂肪组织中 microRNA 的水平发 转染试剂 lipofectamine2000、DMEM、非必需氨基酸
[9]
生改变,从而影响能量代谢稳态 。miR⁃190⁃5p (non⁃essential amino acids,NEAA)、glutamine、0.25%
(miR⁃190)位于染色体15q22.2的 TLN2基因内含子 胰酶(trypsin)、胎牛血清及其他细胞培养试剂(Life
区。最近,越来越多的相关研究表明其与人类疾病之 technologies 公司,美国);荧光素酶报告基因试剂盒
[10]
间具有相关性,尤其是在癌症的发生和发展方面 。 (Promega公司,美国)。
已知 miR⁃190 在多个组织中存在表达,但是其在脂 1.2 方法
肪组织中以及衰老进程中发挥的具体作用和分子 1.2.1 小鼠实验
机制仍不明确 [10] 。本研究对miR⁃190在脂肪细胞中 小鼠麻醉取血后处死,迅速收集褐色脂肪组织
的作用进行探究,鉴定衰老过程中miR⁃190水平的改 (intrascapular brown adipose tissue,iBAT)与皮下白
变及其在衰老相关代谢稳态失衡中的作用,探讨miR 色脂肪组织(inguinal white adipose tissue,iWAT)于
⁃190调控脂肪组织能量代谢稳态的分子机制。 液氮中速冻后保存于-80 ℃超低温冰箱,待进一步
检测。体内miR⁃190 antagomir抑制剂作用通过定点
1 材料和方法
注射iBAT与iWAT部位进行。
1.1 材料 1.2.2 代谢笼
小鼠模型:实验所用小鼠 C57BL/6J(上海斯莱 将待检测的小鼠称量体重后每只单独放入检
克实验动物公司),均为年龄 4~8 周龄的雄鼠,待其 测小室,提供充足的粮食和饮用水后密封。启动自
成年后进行实验。动物20~22 ℃恒温饲养于无特定 动化小鼠新陈代谢监测系统,录入小鼠体重后开始
病原体(specific pathogen free,SPF)级动物房,每12 h 检测。
开关照明昼夜循环,以正常饲料饲养。本研究所有 1.2.3 HE染色
小鼠实验均严格遵循动物实验“3R”原则,按照中华 新鲜组织用 8%多聚甲醛固定 24~48 h 后脱水,
人民共和国国家标准《实验动物福利伦理审查指 石蜡包埋;修石蜡块、切片、展片、贴片、烤片(55~
南》(GB/T27416⁃2014)执行。 60 ℃)3~10 h;将切片依次放入二甲苯中 10 min
细胞系:褐色脂肪前体细胞(brown adipose cell, (2 次)、无水乙醇中5 min(2次)、95%乙醇中5 min、
BAC)细胞系,细胞培养基:改良杜氏伊格尔培养基 80%乙醇中片刻、70%乙醇中片刻脱蜡,后双蒸水洗
(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)+ 5 min;将切片用苏木素染液染色 5 min 后双蒸水洗
10% 胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)+1%青链霉素 片刻;将切片用0.5%盐酸酒精分色约10 s,自来水洗
混合液(penicillin⁃streptomycin solution,PS)。3T3 L1 返蓝(约20 min);将切片置于70%乙醇中5 min、80%
细胞系,脂肪前体细胞,细胞培养基:DMEM+10% 乙醇中5 min,然后用伊红染液(95%乙醇配制)染色
新生牛血清(newborn calf serum,NCS)+1%PS+生物 约 20 s;将切片依次置于95%乙醇中5 min、无水乙醇
素(8 mg/L)+ 泛 酸(17 μmol/L)。 所 有 细 胞 置 于 中5 min、二甲苯+乙醇(1∶1)中 5 min 和二甲苯
37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养,每天观测 中 5 min(2 次);中性树胶封片,正置显微镜观察拍
细胞生长状态。 摄照片。
泛酸酯、生物素、3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄嘌呤(3⁃iso⁃ 1.2.4 细胞培养、诱导及分化
butyl⁃1⁃methylxanthine,IBMX)、地塞米松(dexameth⁃ 3T3L1脂肪前体细胞使用生长培养基进行普通
asone,Dex)、吲哚美辛(indometacin,Indo)和葡萄糖 传代培养:DMEM+10%NCS+1% PS+1%生物素/泛酸
(D⁃glucose)(Sigma 公司,美国);核糖核酸(ribonu⁃ 酯,细胞生长至70%左右进行传代(生长过密后传代
cleic acid,RNA)反转录试剂盒、克隆用聚合酶链式 会影响之后的细胞分化效率)。需要分化的细胞铺板
反应(polymerase chain reaction,PCR)酶 LA Taq(Ta⁃ 生长接触抑制后继续在生长培养基中维持48 h左右
KaRa 公司,日本);蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂、 (克隆增殖期),用诱导培养基对该状态下的3T3L1细
SYBR GREEN实时定量PCR试剂盒(Roche公司,瑞 胞进行诱导:DMEM+10%FBS+1%PS+1%生物素/泛
士);蛋白定量试剂 Bradford、蛋白 marker PageRuler 酸 + 1 μg/mL insulin + 500 μmol/L IBMX + 1 μmol/L
Prestained Protein Ladde 和蛋白免疫印迹化学发光 Dex。此时3T3L1 细胞需在诱导培养基中至少保持
试 剂 Super West Pico Chemiluminescent Substrate 48 h,然后换为分化培养基:DMEM+10%FBS+1%