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第41卷第2期 张何坚，柏 蓉，鲍丽琴，等. 质子泵抑制剂通过激活钙调神经磷酸酶诱发血管内皮炎症［J］.
2021年2月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（02）：173-180 ·175 ·
进行实验。 DAPI 染液对细胞核进行染色，3 min 后用 PBS 洗净
第一阶段实验以兰索拉唑 10 μmol/L 分别处理 残余 DAPI 染液，以 488 nm 为激发波长在荧光显微
细胞 0、24、48、72 和 96 h，各处理组细胞间 DMSO 镜下进行观察。
含量、总培养时间保持一致。第二阶段实验分为 1.3 统计学方法
Veh 组、LPZ 组、FK506 组、LPZ+FK506 组共 4 组。 实验数据以均数±标准差（x ± s）的形式表示，所
Veh 组为对照组；LPZ 组中含有 10 μmol/L 兰索拉 有数据均使用SPSS 22.0 软件进行统计分析，多组间
唑；FK506 组中含有1 μmol/L FK506；LPZ+FK506组 的比较使用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统
中含有1 μmol/L的FK506和10 μmol/L的兰索拉唑， 计学意义。每项实验均独立重复 3 次，使用 Graph⁃
各组间DMSO含量保持一致，共同培养96 h。 Pad Prism 5软件进行作图。
1.2.2 qRT⁃PCR法检测各组细胞中IL⁃6、ICAM⁃1和
2 结 果
VCAM⁃1 mRNA表达
用浓度为 10 μmol/L 的兰索拉唑孵育细胞 0、 2.1 兰索拉唑能时间依赖性激活 CaN，并促进
24、48、72、96 h后，用TRIzol试剂盒提取各组细胞的 NFAT向核内转移
总 RNA，调齐浓度后逆转录成 cDNA。以每孔 5 μL 为了研究兰索拉唑长期作用对 HUVEC 中 CaN
SYBR Green、0.2 μL 正向引物、0.2 μL 反向引物、3.6 表达的影响，分别用兰索拉唑处理细胞 24、48、72、
μL 无酶水和 1 μL 经稀释的 cDNA 配成 10 μL 反应 96 h后，应用Western blot技术进行检测。结果如图
体系。每个样本设置 3 个复孔，上样结束后经 4 ℃ 1A 所示，兰索拉唑可以时间依赖性地上调细胞中
2 000 r/min离心5 min以除尽气泡。上机进行IL⁃6、 CaN 蛋白的表达。此外，本研究进一步探索了细胞
ICAM⁃1 和 VCAM⁃1 等基因的扩增，以 GAPDH 为内 中 NFAT 的表达情况。结果如图1B、C所示，兰索拉
参分析经不同时间药物作用后相关基因 mRNA 表 唑能减少细胞浆中NFAT的表达，并能时间依赖性上
达水平的变化。 调细胞核中NFAT蛋白的表达，免疫荧光结果（图1D）
1.2.3 Western blot法检测蛋白表达 与Western blot结果一致，共同说明兰索拉唑长期反
细胞经不同药物处理后，用 RIPA 裂解液和核 复刺激会诱导细胞浆中的NFAT向细胞核内转移。
浆蛋白提取试剂盒（使用前 2 min 内加入蛋白酶抑 2.2 兰索拉唑诱导血管炎症，增加 HUVEC 黏附分
制剂）分别提取细胞总蛋白、核蛋白和浆蛋白。提 子表达
取的蛋白用细胞破碎仪超声 3~5 次，每次 5 s，随后 为了研究兰索拉唑对 HUVEC 黏附分子和炎症
离心取上清。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，调齐浓 因子表达的影响，分别用兰索拉唑处理细胞24、48、
度后加入5×蛋白上样缓冲液煮沸10 min，变性后的 72、96 h 后，用 Western blot 和 qRT⁃PCR 技术进行检
蛋白样本立即使用或保存于-80 ℃冰箱。使用SDS⁃ 测。结果显示，兰索拉唑可以增加 HUVEC 中 IL⁃6
PAGE按照每孔35 μg的上样量进行电泳，待蛋白分 蛋白的表达，且在96 h时最为明显（图2A、B）。兰索
离后停止电泳。用湿转法将蛋白转移至 PVDF 膜 拉唑还可以时间依赖性增加 ICAM⁃1 蛋白的表达
上，室温条件下用 5%脱脂奶粉溶液封闭 90 min，经 （图 2A、C），而对于 VCAM⁃1，虽然未呈现时间依赖
TBST 漂洗后放入相应的一抗中，4 ℃孵育过夜。次 性，给药 48、72 、96 h 后蛋白表达也出现显著上调
日用TBST缓冲液漂洗3次，每次 10 min。室温条件 （图 2A、D）。此外 qRT⁃PCR 结果显示，兰索拉唑能
下在摇床上孵育二抗约 1 h，结束后仍用 TBST 缓冲 时间依赖性增加 ICAM⁃1 mRNA 的表达（图 3B），而
液漂洗3次，最后使用Tanon显色系统进行显影。以 对于 IL⁃6 及 VCAM⁃1 mRNA 的表达水平，虽然未出
GAPDH 为内参，用 Image J 软件对 Western blot 条带 现统计学差异，但随着给药时间的增加也出现了上
进行半定量分析，各给药组目的蛋白的表达用对照 调趋势（图 3A、C）。这些结果共同说明长时间的兰
组进行标准化。 索拉唑刺激可能诱发血管内皮炎症，并增加内皮细
1.2.4 免疫荧光 胞黏附。
细胞经不同药物处理后，在室温条件下固定 2.3 CaN抑制剂能缓解兰索拉唑诱导的血管损伤
15 min，结束后用 Triton 破膜 15 min，弃去 Triton，用 为了进一步验证 CaN 活化在兰索拉唑诱导的
山羊血清室温封闭 1 h，结束封闭后加入一抗过夜， 血管炎症中发挥的作用。本研究使用 CaN 抑制剂
次日加入荧光二抗室温孵育 1 h，PBS 漂洗 3 次后用 FK506（1 μmol/L）单独或联合兰索拉唑共同孵育细
