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第41卷第4期         陈剑双，殷玥琪，成 浩，等. 2014—2016年无锡市HIV/AIDS病毒亚型及耐药变化分析［J］.
                  2021年4月                   南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（04）：612-616，627                     ·613 ·


                    人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency vi⁃           置于-80 ℃保存备用。②HIV⁃1 前病毒 DNA 提取：
                rus，HIV）⁃1 基因具有高度变异性，在复制过程中不                      采用TIANamp Blood DNA Kit（北京天根生化科技有
                断发生的突变和重组导致多种新亚型的产生，给疾                            限公司），根据说明书标准操作流程，从200 μL外周
                                     ［1］
                病防控带来极大挑战 。目前 HIV 基因数据库                           血淋巴细胞中提取前病毒DNA。③目的基因扩增：
               （HIV sequence database）中已收集 102 种循环重组              使用TaKaRa Ex Taq Hot Start Version（北京宝日医
                                                                                    TM
                型（circulating recombinant form，CRF）毒株序列，而         生物技术有限公司）对 pol 区、env 区和 gag 区 HIV⁃1
                且仍在不断地更新 。此外还存在大量难以确定基                            基因片段进行巢式 PCR 扩增。所需引物及反应条
                                ［2］
                因型的独特重组型（unique recombinant form，URF）             件参照文献［7］。④扩增产物鉴定及测序：扩增产
                                    ［4］
                    ［3］
                病毒 。相关研究表明 ，HIV⁃1基因型在全球范围                         物采用1%琼脂糖凝胶电泳确认后送至生工生物工
                分布相对稳定，但重组毒株的流行在不断上升，亚                            程（上海）股份有限公司进行测序。
                型多样性持续增加。HIV 耐药可分为原发性耐药                           1.2.2 亚型及耐药分析

               （transmitted drug resistance，TDR）和获得性耐药（ac⁃            以pol、env和gag 3个片段基因分型结果综合判
                quired drug resistance，ADR）。近年来，对于未接受             断感染者的基因型，2 个及以上片段分型结果一致

                过高效抗逆转录病毒治疗（highly active antiretrovi⁃            则确定为该型别，将无法确认型别的序列标记为
                ral therapy，HAART）的HIV 感染者TDR 的关注日益               URF。将完成比对及人工校正的 pol 序列提交至美
                增加。TDR的高流行率会限制治疗方式的选择，损                           国斯坦福大学 HIV 耐药数据库（https：//hivdb.stan⁃
                害当前治疗方案的效果并增加治疗失败的风险。                             ford.edu/）进行耐药分析。对 NRTI、NNRTI、蛋白酶
                ADR在抗病毒治疗失败患者中更为普遍，主要表现                           抑制剂（PI）任意一类抗病毒药物出现耐药突变（高
                为对核苷类逆转录酶抑制剂（NRTI）和非核苷类逆                          度、中度、低度）判定为耐药。耐药程度根据耐药分
                转录酶抑制剂（NNRTI）耐药，这两类药也是目前我                         数分级：高度耐药为≥60 分，中度耐药为 30~59 分，
                                            ［5］
                国免费抗病毒治疗的首选药物 。耐药病毒株是                             低度耐药为15~29分。
                HIV 抗病毒治疗广泛开展后不可避免的产物，会影                          1.2.3 质量控制
                响一线抗反转录病毒治疗的效果，如耐药位点进一                                为排除实验过程对亚型及耐药变异的影响，本
                步积累，会导致更广泛、更复杂的耐药 。因此本研                           实验全程进行严格的质量控制。①在核酸提取过
                                                 ［6］
                究通过对 2014 年江苏省无锡市新发现 HIV⁃1 感染                     程中，每 24 个血样设置 1 个阴性血清对照；②阴性
                者进行病毒亚型分型及耐药检测，并于 2016 年随                         对照随样本一同进行扩增及测序，当此阴性对照出
                访，对比其亚型及耐药的变化情况，为抗病毒治疗                            现阳性结果时，对应批次实验结果废弃重做；③所
                策略提供建议。                                           有测序结果拼接及校对完成后，上传至HIV 序列数
                                                                  据 库 中 采 用 ElimDupes 功 能（https：//www.hiv.lanl.
                1  对象和方法
                                                                  gov/content/sequence/elimdupesv2/elimdupes.html）进
                1.1  对象                                           行重复序列比对，排除潜在实验室污染。
                    以江苏省无锡市疾病预防控制中心2014年1月                        1.3  统计学方法
                1 日—12 月 31 日确认和管理的 HIV 感染者/艾滋病                       使用 Excel 2016 软件整理数据，运用 SPSS 23.0
                患者（HIV/AIDS）为研究对象。纳入标准：①感染者                       软件进行统计学分析。定性资料采用率或构成比
                于 2014 年被诊断感染 HIV，未进行过抗病毒治疗，                     （%）描述，用χ 检验或 Fisher 确切概率法进行组间比
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                采集血样1次；②感染者在无锡市治疗满2年，且于                           较；定量资料采用均数±标准差（x ± s）描述，t检验用
                2016年采集血样1次。本研究经中国疾病预防控制                          于两组间比较。P < 0.05 为差异具有统计学意义。
                中心艾滋病预防控制中心伦理委员会批准，研究对
                                                                  2  结 果
                象对其个人基本人口学信息及血样用于开展后续
                分子流行病学研究知情同意。                                     2.1  研究对象基本特征

                1.2  方法                                               研究对象为 2014 年纳入调查并在 2016 年完成
                1.2.1 基因扩增与测序                                     随访且采集血样的117例HIV感染者，以男性为主，
                    ①样本采集：由无锡市疾病预防控制中心技术人                         占 85.47%（100/117）；年龄 15~72 岁，平均（39.41±
                员于2014年及2016年分别采集感染者血样10 mL，                      13.81）岁；文化程度以初中及以上为主（87.18%，
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