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第41卷第7期           吴   春，张小梅，向 阳，等. GDF15激活ERK/Bcl⁃2通路增强BM⁃MSCs放射抗性［J］.
                  2021年7月                   南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（07）：976-983，991                     ·977 ·


                    随着放射技术在军事、医药和其他行业的大量                          试剂（Invitrogen 公司，美国），GDF15、p⁃ERK1/2、
                应用，急性放射综合征（acute radiation syndrome，              ERK1/2 抗体（Abcam 公司，美国），Caspase3、Cleaved
                ARS）的研究也越来越受到人们的重视。放射造成                           caspase3 抗体（CST 公司，美国），Bcl⁃2、Bax、β⁃actin
                造血系统损伤，导致骨髓造血功能障碍，严重时可                            抗体（上海碧云天生物技术有限公司）。
                危及生命。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesen⁃                  1.2  方法
                chymal stem cells，BM⁃MSCs）作为骨髓造血微环境               1.2.1 细胞培养
                的重要组成部分，其自身及其后代子细胞可为造血                                BM⁃MSCs使用专用BM⁃MSCs培养基培养，原代
                干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）提供物理支           细胞复苏于T⁃75细胞培养瓶中，37 ℃，5% CO2的培
                撑。此外，BM⁃MSCs也可通过分泌多种造血/细胞因                        养箱中培养，视为P1代细胞。细胞融合度达到85%~
                子，对 HSCs 的自我更新、分化及骨髓定植均发挥重                        90%，1∶3传代为P2代细胞。本研究使用P6~P10代
                要作用   ［1-3］ 。目前认为，相较于HSCs，BM⁃MSCs具有               细胞进行后续细胞实验。
                较强的放射抗性，其相关的放射抗性机制主要包括：                           1.2.2 细胞分组及放射处理
                DNA损伤的有效识别，双链断裂修复及细胞凋亡逃                               实验分为3组：空白对照组、干扰对照组和干扰
                                                     ［4］
                逸等，但目前其具体机制尚未被完全阐明 。鉴于                            GDF15组。采用Co⁃60 γ射线对细胞进行放射处理，
                BM⁃MSCs的存活可为放射损伤后造血重建提供基质                         处理剂量为9 Gy，剂量率为0.65 Gy/min         ［14］ 。
                干细胞基础，因此，深入研究其放射抗性机制，对探索                          1.2.3 GDF15 siRNA干扰片段转染BM⁃MSCs
                骨髓型急性放射病救治的新策略具有重大意义。                                 取对数生长期的细胞，接种于6孔板中，融合度
                    生 长 分 化 因 子 15（growth differentiation factor  在 70%。按 Lipofectamine 3000 试剂说明书的比例
                15，GDF15）是转化生长因子β（transforming growth             配比各试剂，室温孵育 15 min，加入 6 孔板中，24 h
                factor β，TGF⁃β）超家族中的一员，在各种细胞和组                    后收集细胞检测 mRNA 的表达，72 h 后收集细胞检
                织中广泛分布，伴随着不同的应激反应，如炎症、心                           测蛋白的表达。GDF15干扰片段靶序列如下：干扰
                脏缺血再灌注、急性组织损伤、放射、癌症等，GDF15                        片段1：5′⁃CCATGGTGCTCATTCAAAA⁃3′；干扰片段
                的表达会大幅增加        ［5-9］ 。既往研究表明，GDF15在部             2：5′⁃GACTCCAGATTCCGAGAGT⁃3′；干扰片段 3：
                分癌细胞中高表达，并且在癌症的不同进展阶段具                            5′⁃CCAACTGCTGGCAGAATCT⁃3′。
                有促凋亡和抗凋亡两种效应             ［10-12］ 。本课题组前期研         1.2.4  蛋白免疫印迹分析（Western blot）检测蛋白
                究结果显示，BM⁃MSCs 放射后，GDF15 的表达显著                     表达
                升高  ［13］ ，其是否在BM⁃MSCs的放射抗性中发挥关键                       收集细胞，PBS洗1次，加入RIPA裂解液提取细
                作用，目前尚不清楚。本研究考察了放射后上调的                            胞总蛋白；冰上裂解 30 min，10 000 g 4 ℃离心 15
                GDF15表达在BM⁃MSCs放射抗性中的作用，并初步                       min，收上清；BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓
                探讨了其可能作用机制。                                       度测定，加入1/5体积蛋白上样缓冲液，煮沸10 min，
                                                                  使蛋白变性。根据目的蛋白分子量配制浓度为
                1  材料和方法
                                                                  12%的SDS⁃PAGE凝胶，按照30 μg总蛋白上样，100
                1.1  材料                                           V 电泳，200 mA 转膜；5% BSA 室温封闭 1 h，一抗孵
                    人 BM⁃MSCs、人 BM⁃MSCs 培养基（ScienCell 公           育4 ℃过夜，抗体使用浓度：GDF15抗体（1∶1 500）、
                司，美国），人 GDF15 干扰片段（广州锐博生物科技                       p⁃ERK1/2、ERK1/2、Caspase3、Cleaved caspase3、Bcl⁃

                有限公司），逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ                  2、Bax、β⁃actin 抗体（1∶1 000），TBST 洗膜 3 次，二抗
                试剂盒（大连宝生物工程有限公司），Western blot转                    室温孵育2 h，洗膜3次，ECL显影曝光并拍照，实验
                膜液、一抗稀释液、二抗稀释液、封闭液、RIPA 细胞                        重复3次。
                裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS⁃PAGE凝胶                       1.2.5 RT⁃qPCR检测mRNA水平

                电泳配制试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒 JC⁃1                              收集细胞，每管加入1 mL TRIzol试剂提取细胞
               （上海碧云天生物技术有限公司），PCR 引物（上海                          总 RNA，移液枪反复吹打直至无明显沉淀，室温裂
                生工生物工程股份有限公司），PI staining 检测试剂                    解 30 min；加入上述裂解液体积 1/5 的氯仿，涡旋室
                盒、Annexin V⁃PE/7AAD 凋亡检测试剂盒（BD 公司，                温静置 15 min，10 000 g 4 ℃离心 15 min；取上层无
                美国），CCK⁃8（同仁化工，日本），Lipofectamine 3000             色液体转移至新的无酶EP管中，向上述无色液体中
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