Page 48 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第7期
               ·978 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年7月


              加入同等体积异丙醇，混匀室温静置10 min，10 000 g                   1.2.10 线粒体膜电位检测
              4 ℃离心10 min，弃上清；加入800 μL 75%乙醇清洗                       取对数生长期细胞，2×10 个/孔接种于 24 孔板
                                                                                           4
              沉淀，7 500 g 4 ℃离心 10 min，弃上清，室温干燥沉                 中，24 h 后转染各组细胞，9 Gy 放射处理；分别收取
              淀；加入 20 μL DEPC 水，溶解 RNA，测 RNA 浓度。                未放射、放射后 8 h 细胞。阳性对照设置：阳性对
              按照 TaKaRa 的逆转录试剂盒说明书操作步骤反转                        照孔中加入碳酰氰基⁃对⁃氯苯腙（CCCP，使用浓度
              录得到cDNA，进行RT⁃qPCR。引物序列：GDF15上                     为 10 μmol/L）处理细胞 20 min。吸除培养基，PBS
              游：5′⁃GACCCTCAGAGTTGCACTCC⁃3′，下游：5′⁃               洗 1 次，加入 500 μL JC⁃1 染色工作液，细胞培养箱
              GCCTGGTTAGCAGGTCCTC ⁃ 3′ ；β ⁃ actin 上 游 ：5′ ⁃     中孵育 20 min；吸除上清，PBS 洗 2 次，加入 1 mL 细
              AGCCTCGCCTTTGCCGA⁃3′，下游：5′⁃CTGGTGCCT⁃             胞培养液，荧光显微镜观察拍照，实验重复3次。
              GGGGCG⁃3′，每组3个复孔，实验重复3次。                          1.3  统计学方法
              1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡                                      采用SPSS 19.0软件进行统计分析，实验计量数
                  取对数生长期细胞，1.5×10 个/孔接种于6孔板                     据以均数±标准差（x ± s）表示。同一测量值在不同
                                          5
              中，接种24 h后转染各组细胞；9 Gy放射处理，24 h后                    的时间比较采用重复测量的方差分析；两组间比较
              收集细胞，1 000 r/min 离心 5 min，冰 PBS 清洗 3 次；           采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差
              根据凋亡检测试剂操作说明书，按照每孔100 μL 结                        分析和 LSD⁃t 检验，方差不齐数据采用 Tamhane’s
              合液，5 μL Annexin V⁃PE 和 5 μL 7⁃AAD 配制检测            T2检验进行比较。P ˂ 0.05为差异有统计学意义。
              液，分别加入各组细胞中，重悬混匀，室温避光孵育
                                                                2  结 果
              15~30 min，流式细胞仪检测，每组3个复孔，实验重
              复3次。                                              2.1  放射诱导BM⁃MSCs中GDF15表达上调
              1.2.7 流式细胞仪检测细胞周期                                      为明确放射后BM⁃MSCs中GDF15的表达情况，
                  取对数生长期细胞，接种于25 cm 细胞瓶中，细                      分别通过RT⁃qPCR、Western blot和免疫荧光检测细
                                                2
              胞融合度达60%转染各组细胞；9 Gy放射处理，24 h                      胞经放射处理后不同时间点 GDF15 的 mRNA 和蛋
              后收集细胞，1 000 r/min 离心 5 min，PBS 清洗 3 次，            白表达水平。结果显示，GDF15 的 mRNA 和蛋白水
              75%冰乙醇固定，4 ℃冰箱过夜；PBS 洗 3 次，PI 染                   平在放射后显著升高（图1A、B）。同时，免疫荧光的
              色，重悬混匀，室温避光孵育 15 min，流式细胞仪检                       结果也证实，放射可诱导 GDF15 的表达增加（图
              测，每组3个复孔，实验重复3次。                                  1C）。综上，在 BM⁃MSCs 细胞经放射诱导后 GDF15
              1.2.8 CCK⁃8检测细胞增殖                                 的表达上调。
                  取对数生长期细胞，2 000 个/孔接种于 96 孔板                   2.2  GDF15干扰效果验证
              中，24 h 后转染各组细胞，9 Gy 放射处理；72 h 后弃                       为明确放射后高表达的 GDF15 在 BM⁃MSCs 放
              培养基，按照每孔100 μL培养基，10 μL CCK⁃8试剂                   射抗性中的作用，我们采用脂质体转染 siRNA 片段
              配制检测液，分别加入 96 孔板中，37 ℃避光孵育 2                      干扰 GDF15 的表达，并于细胞转染 24 h 后，进行
              h，酶标仪 450 nm 检测吸光度，每组 5 个复孔，实验                    mRNA 检测。结果显示，与干扰对照组相比，3个干
              重复3次。                                             扰片段均能有效降低 GDF15 的 mRNA 表达水平（P
              1.2.9 免疫荧光染色                                      ˂ 0.05，图 2A），其中干扰片段 1 的 mRNA 抑制效率
                  取对数生长期细胞2×10 个/孔接种于激光共聚                       达到75%；细胞转染72 h后，进行蛋白检测，结果显
                                        4
              焦皿中，24 h 后转染各组细胞，9 Gy 放射处理；分别                     示，与干扰对照组相比，3个干扰片段均能有效降低
              收取未放射、放射后8 h和放射后24 h 3个时间点细                       GDF15 蛋白表达（P ˂ 0.05，图 3B、C）。综合上述结
              胞；弃培养基，PBS洗1次，37 ℃ 4%多聚甲醛室温固                      果，干扰片段1的抑制效果最好，并拟采用此片段进
              定30 min，PBS洗3次；0.2% Triton X⁃100破膜30 min，         行后续的干扰实验。
              PBS 洗 3 次：5% BSA 封闭 1 h；GDF15 一抗（1∶200）           2.3  干扰GDF15的表达可降低BM⁃MSCs放射后细
              4 ℃孵育过夜，PBS 洗 3 次；二抗 37 ℃避光孵育 3 h，                胞增殖

              PBS 洗 3 次；DAPI 染色 10 min，室温避光，PBS 洗 3                  为明确 GDF15 表达水平对放射前后细胞增殖
              次；抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察拍照，                           的影响，我们检测了细胞周期和细胞增殖活力。收
              实验重复3次。                                           取未放射和放射后 24 h 的 BM⁃MSCs 细胞，通过 PI
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