Page 86 - 南京医科大学学报自然科学版
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第41卷第7期
               ·1016 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年7月


                  大量研究表明，中枢对外周器官的调控可以通                          1.2  方法
              过各种神经肽、神经激素和神经递质实现，其中下                            1.2.1 动物造模和给药
              丘脑⁃垂体⁃靶腺轴在调节外周的能量代谢、生长发                                将大鼠随机分为5组，分别为对照组（Ctr）、LPS
                               ［1］
              育中发挥重要作用 。肝脏是糖、氨基酸、脂质和胆                           造模 30 min 组（LPS 30 min）、LPS 造模 24 h 组（LPS
              固醇等营养素代谢中心，也参与维持免疫系统平                             24 h）、色甘酸钠+LPS 30 min组（cro+LPS 30 min）、色
              衡，是许多生理病理过程的关键枢纽，在消化系统                            甘酸钠+LPS 24 h组（cro+LPS 24 h），每组12只。
              中具有重要地位 。近年来，中枢神经系统在肝脏                                 由于脑内肥大细胞富集于下丘脑区域，肥大细
                             ［2］
              调节代谢中的作用引起了越来越多的关注 。机体                            胞稳定剂色甘酸钠脑立体定位给药于单侧下丘脑
                                                    ［3］
              的代谢状态与甲状腺激素水平息息相关，甲状腺激                            区域。大鼠经戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉
              素通过靶基因的转录调控来实现肝脏脂质及能量                             后，被固定在脑立体定位仪（Stoelting Instruments 公
              稳态的调节 。                                           司，美国）中，并使用加热垫保持在37 ℃。给药套管
                        ［4］
                                                                                             ［9］
                  肥大细胞在中枢神经系统中普遍存在，主要位                          定位在右侧下丘脑中，位置如下 ：前囟右1.80 mm，
              于丘脑⁃下丘脑区 ，通过分泌大量血管活性物质、                           前囟后 1.90 mm，前囟下深 8 mm，倾斜角度为 10°。
                              ［5］
              细胞因子和蛋白酶等参与过敏和局部炎症反应 ，                            手术后，待动物自然清醒分笼饲养，每天对动物进
                                                         ［6］
              可能在神经免疫反应中发挥作用 。尽管有研究                             行套管检查。14 d 后，色甘酸钠组大鼠经套管给予
                                             ［7］
              发现中枢神经系统和炎性肝脏疾病具有相关性 ，                            2 μL 色甘酸钠（100 μg/μL）预处理。其余组大鼠
                                                         ［8］
              但神经系统内的特异性细胞群在肝脏炎症中的作                             用 2 μL 无菌生理盐水预处理。预处理30 min后，4组
              用研究甚少。因此，本研究旨在阐述脑内的肥大                             实验组大鼠腹腔注射LPS（1 mg/kg），而对照组注入无
              细胞在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肝脏               菌生理盐水。LPS注射30 min或24 h后，用50 mg/kg
              炎症中的调节作用，并探讨这种调节作用是否与                             戊巴比妥钠麻醉大鼠，然后处死。收集大鼠大脑、
              下丘脑⁃垂体⁃甲状腺（hypothalamic⁃pituitary⁃thyroid，        肝脏和血液样本，所有样本均按要求储存。
              HPT）轴有关。                                          1.2.2 酶联免疫吸附实验
                                                                     采用 ELISA 方法测定 TNF⁃α、IL⁃6、TSH、T3 和
              1  材料和方法
                                                                T4，按试剂盒说明书进行操作。
              1.1  材料                                           1.2.3 病理组织学检查
                  雄性 Sprague⁃Dawley（SD）大鼠（220~250 g），购               用常规方法将 10%福尔马林固定石蜡包埋的
              自南京医科大学医药实验动物中心。在标准实验                             肝组织切片分为4 μm切片，用盖玻片固定于载玻片
              室条件下［温度（25±2）℃，相对湿度（60±10）%，室                     上。根据标准方案，用苏木精和伊红（HE）对每个固
              内换气 12~18 次/h，室内光/暗循环 12 h］饲养，每                   定 肝 脏 的 代 表 性 切 片 进 行 染 色 。 利 用 Leica
              笼 5 只。适应1周后开始本研究，并按照正常的饮食                         DM2500显微镜和图像分析显微系统对切片进行观
              和水随意喂养。本研究由南京医科大学实验动物福                            察。由同一位有经验的组织病理学家以盲法提供
              利伦理委员会批准（IACUC⁃2104041），所有实验均按                    所有的组织学分析。
              照中华人民共和国国家科学技术委员会制定的《实验                           1.2.4 蛋白免疫印迹分析
              动物管理条例》进行。LPS、色甘酸钠均购自美国                                100 mg肝脏标本在200 μL RIPA裂解缓冲液中
              Sigma 公司。BCA 蛋白检测试剂盒购于上海碧云天                       匀浆，置于冰上保存30 min，然后在4 ℃，12 000 g离

              生物技术有限公司。兔多克隆 NF⁃κB 抗体、c⁃JNK                      心 15 min。采用 BCA 蛋白检测试剂盒测定上清液
              抗体、p⁃JNK抗体、p38抗体、p⁃p38抗体、ERK抗体、p⁃                 中的蛋白含量。蛋白质（60 μg）用样品缓冲液变性，
              ERK抗体、AKT抗体、p⁃AKT抗体、Lamin B抗体及兔                   SDS⁃PAGE电泳分离，将分离的蛋白转移到PVDF膜

              单克隆 GAPDH 抗体、羊抗兔二抗均购于美国 Cell                      上。在室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入一抗
              Signaling 公司。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor         在 4 ℃下孵化过夜，然后加入抗兔二抗孵育 1 h，用
              α，TNF⁃α）、白细胞介素⁃6（interleukin 6，IL⁃6）、促甲状          增强化学发光试剂盒显影蛋白条带。每个免疫印
              腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、三碘甲状         迹实验重复3次。

              腺原氨酸（triiodothyronine，T3）和甲状腺素（thyrox⁃            1.3 统计学方法
              ine，T4）ELISA试剂盒购于美国R&D公司。                              采用 SPSS 13.0 软件进行统计分析。数据以均
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