Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 24

第41卷第9期
               ·1290 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2021年9月


                  脓毒血症是一种由病原菌、创伤、外科感染等                          博士德生物），IL⁃1β ELISA 试剂盒（ab100705，Ab⁃
              因素引起的全身性炎症反应综合征（systemic in⁃                      cam 公司，美国）。丙二醛测定试剂盒（malondialde⁃
              flammative reaction syndrome，SIRS），其特点是对感         hyde，MDA，A003⁃1⁃2）、超氧化物歧化酶测定试剂盒
              染性损伤的全身炎症反应。这一过程往往导致广                             （superoxide dismutase，SOD，A001⁃3⁃2）、谷胱甘肽 S
              泛的组织损伤和多器官功能障碍，而急性肝损伤                             转移酶试剂盒（glutathione S transferase，GST，A004⁃1
             （acute liver injury，ALI）是其最常见的并发症          ［1- 2］ 。  ⁃1）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR，
              既往研究表明，内毒素脂多糖（lipopolysaccharide，                 A062⁃1⁃1）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxi⁃
              LPS）是引起急性肝损伤的主要因素 ，LPS 可以显                        dase，GPX，A005⁃1⁃2）、过氧化氢酶（catalase，CAT，
                                               ［3］
              著上调炎性细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子α                             A007⁃1⁃1）（南京建成生物工程研究所）。光学显微
             （tumor necrosis factor α，TNF⁃α）和白细胞介素⁃1β           镜（Olympus BX41）及 透 射 电 镜（TEM，HT7700）
             （interleukin⁃1β，IL⁃1β），而这些细胞因子会引起严                 （Olympus公司，日本）。
              重的肝组织损伤        ［4-5］ 。此外，氧化应激也被认为在                     6~8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重20~25 g（合格
              ALI 的发生发展中起到重要作用 。肝脏中活性                           证 号 ：201716345，常 州 卡 文 斯 实 验 动 物 有 限 公
                                            ［6］
              氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的过量产             司）。动物饲养于东南大学医学院实验动物中心动
              生会破坏细胞的结构和功能完整性，导致广泛的                             物房，温度22~24 ℃，湿度为40%~70%，光照明暗各
                         ［7］
              肝细胞破坏 。到目前为止，仍旧缺乏治疗 ALI 的                         12 h，换气次数为 10~20 次/h。饲料为鼠灭菌饲料，
              有效手段。因此，阐明 ALI 的病理机制，是亟待解                         购自东南大学医学院实验动物中心，符合 GB⁃
              决的问题。                                             15921.2⁃2014标准。饮水为经121 ℃、30 min灭菌自
                  活性维生素D3（vitamin D3，Vit D3）是一种脂溶               来水，由动物经饮水瓶自由摄取。
              性维生素，1，25（OH） 2 D3是其活性形式           ［8-9］ 。研究表     1.2  方法
              明，Vit D3的缺乏与脓毒症的病死率和机械性通气的                        1.2.1 模型建立及分组
              持续时间显著相关        ［10-11］ 。既往研究发现1，25（OH） 2 D3           预先配制 LPS 浓度为 1.0 mg/mL。将 40 只雄性
              的生物学效应主要是由维生素D受体（vitamin D re⁃                    C57BL/6 小鼠按体重随机分为对照组、Vit D3 组、
              ceptor，VDR）介导，VDR 在许多细胞中表达，包括巨                    模型组（LPS 组）和治疗组（LPS+ Vit D3 组），每组
              噬细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等；                           10 只。小鼠给予 15 mg/kg LPS 腹腔注射建立脓毒
              而 Vit D3 通过 VDR 调控细胞增殖、抗炎、抗氧化等                    血症小鼠ALI模型。造模即刻、造模后8 h、16 h，Vit
              信号通路    ［12］ 。大量研究证实Vit D3对ALI具有治疗                D3组和LPS+ Vit D3组再给予2.5 μg/kg Vit D3灌胃，
              作用，而其潜在机制尚不清楚             ［13-14］ 。               对照组和LPS组则给予等体积生理盐水灌胃 。
                                                                                                      ［15］
                  因此，本研究旨在阐明 Vit D3 对 LPS 诱导小鼠                  1.2.2 标本收集
              ALI的保护机制，为临床治疗ALI提供新思路。                                造模后 24 h 处死小鼠。小鼠采用 4%水合氯醛
                                                                腹腔注射麻醉。仰位固定，用一次性注射器（2 mL）
              1  材料和方法
                                                                心尖取血，室温下 3 000 r/min 离心 10 min 后取上清
              1.1  材料                                           液送医院检验科检测肝肾功能，包括丙氨酸氨基转
                  Vit D3（罗盖全 J20150011，罗氏公司，美国），                移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天门冬氨酸

              LPS（L2630，Sigma 公司，美国）。抗血红素加氧酶⁃1                  氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿
             （heme oxygenase⁃1，HO⁃1）抗体（BM4010）、核因子              素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（creatinine，

              E2 相关因子 2（nuclear factor⁃erythroid 2p45⁃related   Scr）水平。开腹取肝，约 2/3 肝固定于 4%甲醛溶液
              factor 2，Nrf2）抗体（PB9290）、抗VDR抗体（BA2877⁃           中做肝脏病理光镜及免疫组化检查，1/3 肝组织置
              2）、抗 TNF⁃α抗体（A00002⁃5）（武汉博士德生物公                   于-80 ℃冰箱保存备用，另取小块肝组织置于 2.5%
              司）；抗 NF ⁃ κB p65 抗 体（8242）、抗 IL ⁃ 1β 抗 体          戊二醛溶液中固定，备电镜检查。
             （12703）、抗 Lamin A/C 抗 体（4777）、抗 鼠 二 抗              1.2.3 肝脏病理检查

             （7076）、抗兔二抗（7074）（Cell Signaling Technology             4%甲醛固定的部分肝组织，经清洗、梯度酒精
              公司，美国）；抗 NF⁃κB p50 抗体（ab131546，Abcam              脱水、浸蜡、包埋等步骤后，制成石蜡块；再用切片机
              公司，美国）。TNF⁃α ELISA 试剂盒（EK0525，武汉                  切出厚度为4 μm切片，摊片、烤片，后按常规操作行
   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29