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第41卷第9期 弓玉祥，倪维杰，倪海锋，等. 活性维生素D3对脓毒血症小鼠急性肝损伤的保护作用及机制［J］.
2021年9月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（09）：1289-1295，1321 ·1291 ·

HE染色。光镜下观察肝组织损伤程度和炎症反应。 1.3 统计学方法
1.2.4 肝脏电镜检查 采用SPSS 20.0统计软件进行分析，实验结果采
小鼠肝脏分离，用生理盐水清洗，切成小块 用均数±标准差（x ± s）表示，采用单因素方差分析，
（1 mm），立即固定在含2.5%戊二醛溶液中，后固定 多个样本之间的两两比较采用 Dunnett’s t 检验，
3
在 1%锇酸溶液中。然后，在梯度酒精中连续脱 P < 0.05为差异有统计学意义。
水。用丙酮代替乙醇后，将组织嵌入环氧树脂中并
2 结 果
切成超薄切片。切片用醋酸铀和柠檬酸铅双染色，
电镜观察。 2.1 Vit D3显著改善肝脏损伤

1.2.5 MDA 水平及 SOD、GST、GR、GPX、CAT 活性 Vit D3 处理显著改善小鼠的生存率（图 1A）。
检测。 与对照组相比，LPS 组血清 ALT 和 AST 的水平显著
将肝组织于冷生理盐水中匀浆，按照厂家提供 增加（P < 0.01，图1B、C）。而Vit D3处理后，这一改
的实验步骤采用比色法测定 MDA 水平和 SOD、 变得到逆转。HE 染色被用来评估肝损伤程度。对
GST、GR、GPX、CAT活性。 照组和 Vit D3 组肝组织结构完整清晰，而 LPS 组的
1.2.6 ELISA法检测小鼠血清TNF⁃α、IL⁃1β含量 肝组织结构混乱，炎细胞浸润显著增多，而这些变
按照厂家提供的步骤采用 ELISA 法测定血清 化被Vit D3所抑制（图1D）。Vit D3处理后小鼠的肾
TNF⁃α、IL⁃1β水平。 功能也得到保护（表1）。
1.2.7 免疫组化检测相关蛋白表达 2.2 Vit D3通过Nrf2/HO⁃1通路改善肝细胞氧化损伤
将肝组织石蜡切片经常规脱蜡和复水处理后， 镜下可以观察到对照组、Vit D3 组肝细胞中正
用微波法进行抗原修复。以3%过氧化氢甲醇溶液 常的线粒体形态，而LPS组线粒体肿胀明显，甚至可
处理切片灭活内源性过氧化物酶后，以10%胎牛血 以观察到线粒体空泡变性，线粒体嵴消失，Vit D3治
清封阻 30 min；分别加入各种一抗，TNF⁃α抗体（1∶ 疗显著抑制了这些变化（图2A）。进一步对MDA和
100）及 IL⁃1β抗体（1∶100），孵育过夜；PBS 冲洗 抗氧化酶活性的检测发现，与对照组和 Vit D3 组相
3 次，每次3 min，后加入二抗，孵育15 min；PBS冲洗 比，LPS组MDA水平显著增加（P < 0.01），SOD、GST、
3 次，每次 3 min，加入 DAB 显色；PBS 冲洗后，以苏 GR、GPX和 CAT的活性显著下降（P < 0.01），而这一
木素复染，自然风干后封片观察。 LPS 诱导的氧化损伤被 Vit D3 所逆转（P < 0.01，图
1.2.8 Western blot检测相关蛋白表达 2B~G）。Nrf2/HO⁃1 通路在氧化损伤中起到重要作
取适量的肝组织，冰上匀浆，使用蛋白提取试 用，进一步研究发现，与 LPS 组相比，LPS+Vit D3 组
剂盒提取蛋白，Bradford 法测定蛋白浓度。每孔上 Nrf2和HO⁃1的表达显著增加（P < 0.01，图2H~J）。
样100 μg蛋白，12%聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）电 2.3 Vit D3处理减少炎症损伤
泳分离，将蛋白转移至 PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封 炎性细胞因子，如 TNF⁃α、IL⁃1β在 LPS 诱导的
闭 2 h，一抗孵育，4 ℃过夜，次日室温孵育 HRP 标 ALI起到关键作用。与LPS组相比，血清TNF⁃α和IL⁃
记的二抗 1 h。化学发光法显示结果，压片曝光， 1β的水平在 Vit D3 处理后显著下调（P < 0.01，图

显影定影，采用凝胶成像分析系统拍照，Bio⁃Rad 3A、B），而肝组织中TNF⁃α和IL⁃1β的蛋白水平与血
Quantity one version 4.6.7 软件对相应条带进行灰 清中一致（图3C~F）。结果显示，在LPS处理后，肝组
度分析。 织中NF⁃κB p65和p50显著升高（P < 0.01），而Vit D3
1.2.9 实时荧光定量PCR检测VDR mRNA的水平 处理逆转了这一改变（P < 0.01，图3G~I）。
取 适 量 的 肝 组 织 加 入 TRIzol 匀 浆 提 取 总 2.4 Vit D3治疗对肝脏核VDR水平的影响
mRNA，核酸分析仪检测样本中 mRNA 的质量；对检 如前文所述，Vit D3 主要通过 VDR 发挥作用，
测合格的样本进行逆转录；按实时荧光定量试剂盒说 因此进一步探究了 VDR 的表达水平。与对照组相
明书依次添加试剂后进行扩增，条件为 95 ℃ 30 s； 比，LPS 组 VDR 表达显著减少（P < 0.01），Vit D3 处
95 ℃ 5 s，61 ℃ 31 s，循环 40 次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s， 理后，VDR表达水平上调（P < 0.01，图4）。
-ΔΔCt
95 ℃ 15 s。使用 2 法分析所得数据。小鼠 VDR
3 讨 论
引物序列，上游 5′⁃CACAAGACCTACGACC⁃CCAC⁃
［1］
3′，下游5′⁃CATCATGTCCAGTGAGGGGG⁃3′。 ALI是一种病死率高、危及生命的临床综合征 。