Page 30 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第1期
· 24 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年1月

polymerase（PARP）protein were detected by Western blot，cell proliferation was detected by MTT，cell ROS levels，apoptosis and cell
cycle were detected by flow cytometr. Results：The ROS，apoptosis rate，Cleaved⁃Caspase 3 and Cleaved⁃PARP level，the proportion of
G1 cells in negative control group were all higher than those in blank control group（all P <0.05），the proliferation rate was lower than
that of blank control group（P < 0.05）. The ROS，apoptosis rate，Cleaved⁃Caspase 3 and Cleaved⁃PARP level，the proportion of G1 cells
in H2O2 group were all higher than those of negative control group（all P <0.05），the proliferation rate was lower than that of negative
control group（P <0.05）. The ROS，apoptosis rate，Cleaved⁃Caspase 3 and Cleaved⁃PARP levels，the proportion of G1 cells in Caspase
inhibitor+H2O2 group were all lower than those of H 2O2 group（all P < 0.05），but were all higher than negative control group（P < 0.05），
the proliferation rate was higher than that of H 2O2 group（P < 0.05），but still lower than that of negative control group（P < 0.05）.
Conclusion：The oxidative stress level of sepsis cell model is abnormally upregulated. Excessive ROS can inhibit the proliferation of
septic renal tubular epithelial cells，promote cell apoptosis and cause cell cycle G1 block through the mitochondrial⁃Caspase pathway.
Inhibition of Caspase has a certain protective effect on renal tubular epithelial cell injury in sepsis caused by ROS.
［Key words］ sepsis；kidney injury；oxidative stress；mitochondria；apoptosis
［J Nanjing Med Univ，2022，42（01）：023⁃029，070］

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是致病因 管上皮细胞，诱导炎症反应和组织细胞损伤。脓
素引起的短时间内肾脏功能急剧下降和/或肾实质 毒症时，病原体相关分子模式被体内的模式识别
损伤，在临床极为常见，在住院患者中的发生率为 受体识别，引发炎症反应；革兰阴性细菌外膜的脂
2％~12％，重症监护室患者可高达 30％ 。AKI 增 多糖（lipopolysaccharide，LPS）是目前脓毒症中研
［1］
加了肾脏病患者进展到终末期的风险，导致预后不 究最多的外源性模式识别分子 。H2O2能在短时
［8］
良，尤其是同时发生肾功能下降和肾实质损伤的患 间内提高细胞中氧化应激水平，且涉及多种信号
［2］
者 。引起 AKI 的病因很多，如缺血⁃再灌注损伤、 通路，被广泛用于体外诱导氧化应激损伤的细胞
［9］
烧伤、药物毒性、脓毒症等，其中脓毒症所致 AKI 占 模型 。本研究通过 LPS 刺激建立人肾小管上皮
临床AKI的比例不断增加，占到AKI病因的29.6％~ 细胞 HK⁃2 的脓毒症细胞模型，用 H2O2和 Caspase 3
［3］
47.6％ 。AKI又能加重其他脏器损伤，引起多器官 特异性肽类抑制剂Ac⁃DEVD⁃CHO 单独或联合干预
功能障碍。与非脓毒症性AKI和单纯脓毒症患者相 细胞，观察 Caspase 依赖的氧化应激对肾小管上皮
比，合并AKI的脓毒血症患者预后明显变差，病死率 细胞损伤的调节作用，探讨脓毒症肾小管上皮损伤
在 50％~80％ 。如何防治 AKI 已经成为全球性的 的机制。
［4］
公共卫生问题，是肾脏病学及重症医学面临的重要
1 材料和方法
挑战。
氧化应激是脓毒症肾损伤的重要机制之一。 1.1 材料
线粒体是肾小管细胞产生活性氧（reactive oxygen 人肾小管上皮细胞HK⁃2 细胞购自中科院典型
species，ROS）的主要来源。脓毒症时，肾组织受全 培养物保藏中心，用含 10％胎牛血清、100 U/mL 青
身炎症反应的影响，ROS 生成增多，最终引起脓毒 链霉素双抗的 DMEM/F12 培养基，在 37 ℃、饱和湿
症肾损伤 。调节 ROS 和氧化应激状态可能成为 度的二氧化碳培养箱中培养。
［5］
脓毒症肾损伤的潜在治疗靶点。线粒体途径是经 兔抗人 Cleaved⁃Caspase 3 多克隆抗体、兔抗人
典的细胞凋亡信号通路。近来研究发现，ROS 爆发 Cleaved⁃PARP 多克隆抗体和兔抗人β⁃actin 多克隆
涉及线粒体途径的细胞凋亡 。肿瘤细胞局部高 抗体（ABI 公司，美国）；酶标羊抗兔 IgG（南京建成
［6］
浓度 ROS 能引起线粒体膜通透性转运孔开放，跨 生物工程研究所）；H2O2、Caspae 3抑制剂Ac⁃DEVD⁃
膜电位降低，细胞色素释放并激活半胱氨酸蛋白 CHO（上海碧云天生物技术研究所）；MTT 试剂盒
酶Caspase，通过下游级联反应导致DNA碱基断裂， （上海生工生物工程有限公司）；Annexin V/PI 凋亡
诱导凋亡 。但脓毒症肾细胞损伤中氧化应激和 检测试剂盒（BD 公司，美国）；DHE 试剂盒（Invitro⁃
［7］
Caspase途径细胞凋亡的研究还较少。 gen 公司，美国）。凝胶成像系统（Bio⁃Rad 公司，美
模式识别分子通过模式识别受体作用于肾小 国），流式细胞仪（BD公司，美国）。