Page 31 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第1期 孙林春，刘建璟，张 利. Caspase依赖的氧化应激对脓毒症肾小管上皮细胞损伤的作用及机制［J］.
2022年1月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（01）：023-029，70 · 25 ·

1.2 方法 底加入 200 μL 50 mg/mL 的 PI 染液，4 ℃避光孵育
1.2.1 脓毒症细胞模型分组 30 min，上流式细胞仪检测细胞周期。
用终浓度 10 μg/mL 的 LPS 处理 12 h 建立脓毒 1.3 统计学方法
症细胞模型，分为：阴性对照组（不做处理）、过氧化 用 SPSS17.0 软件进行数据处理，结果用均数±
氢 组（H2O2 300 μmol/L）、Caspase 抑 制 剂 组（Ac⁃ 标准差（x ± s）表示，两组间比较采用 t 检验；多组间
DEVD⁃CHO 15 μmol/L）、Caspase 抑制剂+过氧化氢 比较用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），组间两
组（H2O2 300 μmol/L+Ac⁃DEVD⁃CHO 15 μmol/L），并 两比较采用 LSD 法。以 P < 0.05 为差异有统计学
以正常培养的HK⁃2细胞为空白对照组。 意义。
1.2.2 Western blot检测
2 结 果
提取细胞总蛋白，用蛋白标准品绘制标准曲
线进行蛋白定量。80 V恒压电泳30 min后，继续用 2.1 H2O2引起脓毒症肾小管上皮细胞凋亡相关蛋
120 V 恒压电泳至蛋白 Marker 跑至距离胶底 1 cm， 白的异常表达
停止电泳。用硝酸纤维素薄膜 90 V 恒压下电转 H2O2 组肾小管上皮细胞 Cleaved⁃Caspase 3 和
2 h。将蛋白膜用封闭液（含 5 %脱脂奶粉）室温封 Cleaved⁃PARP 蛋白表达较阴性对照组显著升高
闭 2 h，再浸入用封闭液按 1∶500 稀释的一抗溶液 （P < 0.05）；两组Cleaved⁃Caspase 3和Cleaved⁃PARP
中，4 ℃过夜；将蛋白膜用 TBST 洗涤 3 次，5 min/次 蛋白均高于空白对照组（P < 0.05，图 1）。结果表
后，再浸入用 TBST 按 1∶1 000 稀释的二抗溶液中， 明，H2O2能引起脓毒症肾小管上皮细胞凋亡相关蛋
室温孵育 1 h。洗膜后，用显影剂显色，用自动凝胶 白异常表达。
成像系统记录并分析 Cleaved⁃Caspase 3 和 Cleaved⁃
PARP蛋白条带。 阴性对照组 空白对照组
1.2.3 ROS检测 H2O2组
将各组细胞制成 1×10 个/mL 单细胞悬液，按 Cleaved⁃Caspase 3 025 kDa
5
100 μL/孔加入流式管中，加入 5 μmol/L DHE，37 ℃
Cleaved⁃PARP 112 kDa
避光孵育30 min，PBS洗涤后，上流式细胞仪检测。
β⁃actin 042 kDa
1.2.4 细胞增殖检测
将细胞按1×10 个/孔接种到96孔板，给予相应 4
3
处理，每组设 6 个平行孔。分别在处理后的 0 h 和 *# H2O2组
阴性对照组
*#
48 h，每孔加入20 μL MTT溶液，置培养箱中孵育4 h。 3 # 空白对照组
用酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光度，计算细胞
存活率，以时间为横坐标，存活率为纵坐标，绘制细 蛋白相对表达量 2 #
胞增殖曲线。
1.2.5 细胞凋亡检测 1
将各组细胞用胰酶消化后，用 PBS 缓冲液制成
1×10 个/mL 单细胞悬液，按 100 μL/孔加入流式管 0
5
Cleaved⁃Caspase 3 Cleaved⁃PARP
中，再分别加入 20 μL Annexin V⁃异硫氰酸（fluores⁃
与阴性对照组相比，P < 0.05；与空白对照组相比，P < 0.05（n=5）。
*
#
cein isothiocyanate，FITC），和 20 μL 碘化丙啶（prop⁃
图1 各组凋亡相关蛋白的表达
idium iodide，PI）。另设单阳管和阴性对照管，室温 Figure 1 Expression of apoptosis⁃related proteins in each
避光孵育 20 min；再加入 500 μL PBS 缓冲液，混匀 group
后上流式细胞仪检测。
1.2.6 细胞周期检测 2.2 Caspase 抑制剂降低氧化应激诱导的脓毒症肾
将各组细胞制成 1×10 个/mL 单细胞悬液，按 小管上皮细胞ROS水平
5
100 μL/孔加入流式管中，加入 1 mL PBS 和 2 mL 无 空白对照组、阴性对照组、H2O2 组、Caspase 抑
水乙醇，用封口膜密封管口置于 4 ℃ 24 h，固定细 制剂组和 Caspase 抑制剂+ H2O2 组细胞中 ROS 平
胞。吸出上清液，加3 mL PBS重悬细胞，离心，向管 均荧光强度分别为 783±67、1 216±92、1 915±122、