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第42卷第1期        刘易昕，何 强，张大鹏，等. 大鼠骨质疏松模型的建立及其骨髓间充质干细胞内差异lncRNA初步分析［J］.
                2022年1月                    南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（01）：030-034，046                      · 31  ·


                and the differentially expressed lncRNA involved in the regulation of BMSCs growth and development process or protein transport
                pathway.
               ［Key words］ osteoporosis；bone marrow mesenchymal stem cell；lncRNA；gene chip
                                                                           ［J Nanjing Med Univ，2022，42（01）：030⁃034，046］





                    骨质疏松是全世界范围内的健康难题，其发病                          部皮肤消毒，沿着腹部中线中下部正中作2 cm长切
                与成骨、破骨代谢之间的失衡有关。促进骨形成、                            口，将皮肤牵开，切开腹膜，进入腹腔，沿双侧子宫
                探究其相关分子生物学机制，对防治骨质疏松具有                            外上角的输卵管找到卵巢，丝线结扎卵巢蒂部，切

                重大意义。骨髓间充质干细胞（bone marrow⁃de⁃                     除大鼠卵巢并取出，缝合腹膜和皮肤切口。对照组
                rived mesenchymal stem cell，BMSC）是一类具有自我          SD大鼠仅切开腹部后沿着输卵管显露卵巢，但不作
                更新和多向分化潜能的细胞群，在体内不同环境下                            卵巢切除，缝合腹膜及皮肤。
                可分化为成骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞，其分                            1.2.2  骨密度（bone mineral density，BMD）检测
                化去向在全身的骨代谢中起到了重要作用 ，外部                                根据实验设计，在实验开始时和饲养 3 个月后
                                                      ［1］
                因素及其信号处理过程如何调控BMSC分化去向是                           分别检测 SD 大鼠的骨密度并进行比较。采用 10%

                当前研究的热点。长链非编码RNA（long noncoding                   水合氯醛以 1 mL/250 g 剂量腹腔内注射麻醉，待麻
                RNA，lncRNA）是高度结构化的RNA转录本，长度超                      醉满意后，将其四肢展开俯卧于双能 X 线吸收测量
                                                           ［2］
                过 200 个核苷酸，不直接参与蛋白的翻译过程 。                         仪（GE 公司，美国）平台上，通过小动物软件测定系
                起初认为 lncRNA 不具备生物学功能，近来研究发                        统测定各组小鼠全身骨骼的骨密度。
                现 lncRNA 可广泛参与基因的表达调控，调节细胞                        1.2.3  BMSC的分离提取、培养及鉴定
                                                                                                             ［8］
                                                           ［2］
                的增殖、分化、凋亡，并与个体的生长发育相关 。                               饲养3个月后的SD大鼠，根据文献介绍方法 ，
                研究表明，lncRNA 在基因水平对BMSC的调控起重                       取大鼠右侧股骨干，无菌条件下沿两侧干骺端剪断，
                要作用，参与 BMSC 分化调控过程中复杂的信号通                         暴露骨髓腔，并以 1 mL 无菌注射器吸取培养基反
                路，从而间接调控骨质疏松疾病的发生和发展                      ［3⁃6］ ，  复冲洗，直至流出的液体变为清亮并且骨的颜色发
                但具体调节机制仍不明确。本研究拟通过制备卵                             白；用移液器将含有小鼠骨髓液的培养基转移至
                巢切除骨质疏松模型，并培养骨质疏松模型大鼠的                            15 mL离心管，轻柔吹打，去除残渣，经离心、重悬后
                BMSC，对细胞内 lncRNA 进行检测，对比研究相关                      以1×10 个/瓶的浓度接种于培养皿内，置于培养箱
                                                                         6
                差异 lncRNA 基因的生物学功能及参与的相关信号                        中，每隔 2 d 更换 1 次培养液，待细胞融合约 80%~
                通路，为后期进一步的验证及功能研究提供基础。                            90%时进行传代操作。选取第3代BMSC，常规消化
                                                                  并制备细胞悬液，1 000 r/min 室温离心5 min后PBS
                1 材料和方法
                                                                  缓冲液重悬细胞，并调整浓度5×10 个/mL加入流式
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                1.1  材料                                           细胞管，在避光条件下按说明书每管分别加入荧光
                    选取雌性 SD 大鼠 12 只，体重（250±10）g，由南                标记的CD45、CD90抗体，4 ℃避光孵育1 h，对细胞进
                京医科大学实验动物中心提供。所有实验均通过                             行1 000 r/min 室温离心5 min后PBS洗涤3次，将细
                南京市中医院伦理委员会批准同意。12只SD大鼠                           胞重悬于加入约1 mL PBS缓冲液，运用流式细胞仪
                分为对照组和骨质疏松组，每组 6 只。骨质疏松组                          检测并计算阳性细胞的比例，结果显示CD45 细胞比
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                采用切除卵巢的方法制作模型，对照组仅采用腹部                            例<1%，而CD90 细胞比例 > 95%。
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                切开不作卵巢切除，均饲养3个月。3个月后每组取                           1.2.4  基因芯片检测差异lncRNA
                3只SD大鼠的BMSC用于基因芯片检测。                                  根据实验设计，取饲养 3 个月后的骨质疏松模
                1.2  方法                                           型组大鼠 3 只和对照组大鼠 3 只，培养其 BMSC，利
                1.2.1  SD大鼠卵巢切除骨质疏松模型建立                           用基因芯片技术检测BMSC内差异lncRNA。
                                                         ［7］
                    根据文献方法制作SD大鼠骨质疏松模型 ，采                             在 Illumina TruSeq™ RNA 样品准备试剂盒使用
                用10%水合氯醛以1 mL/250 g的剂量腹腔内注射麻                      说明书指导下进行RNA提取及文库的制备，最后进
                醉，待麻醉满意后大鼠腹部剪毛，采用碘伏进行局                            行 PCR 富集得到最终的 cDNA 文库。利用 Trimmo⁃
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