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第42卷第2期            丁   骏，潘 洁，谢叶文，等. 莱菔硫烷对小鼠肺癌细胞凋亡的影响及机制研究［J］.
                  2022年2月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（02）：171-177                       ·173 ·


                行反转录反应，再运用荧光定量 PCR 检测，反应体                         法曝光拍照。用Image J对实验结果进行分析。
                系总体积为 20 μL：SYBR Premix ExTapTM Ⅱ（2×）             1.2.8 小鼠成瘤实验
                10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR         取对数生长期的LLC细胞，细胞达80%~90%密
                Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，ROX Reference     度为宜。胰酶消化细胞后用预冷的PBS洗2遍。用
                                                                                                   6
                Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA 1 μL，RNase⁃free H2O         PBS 吹打细胞沉淀至浓度为 3×10 个/mL。每只
                6.8 μL；qRT⁃PCR扩增条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，          C57BL/6J 小鼠腹股沟中上部皮下注射 100 μL 细胞
                60 ℃ 30 s，循环 40 次。在 AB（应用生物系统）公司                  混悬液，建模 1 周待小鼠皮下出现肿块后，随机将
                的7500型实时荧光定量PCR仪上进行。                              小鼠进行分组，给予药物干预，即分别用 PBS 和
                                                                  0.5 mg/kg的SFN灌胃处理，1周5次，连续处理２周，
                              表1 PCR引物的信息                         并对肿块进行测量，1 周 3 次，游标卡尺测量肿瘤最
                        Table 1 Information of PCR primers        长和最短部位。V=1/2×a×b（a为长轴，b为短轴）。
                                                                                          2
                  引物名称                   引物序列
                                                                  1.3  统计学方法
                  Q⁃GAPDH     F：5′⁃AACTTTGGCATTGTGGAAGG⁃3′                                         - ΔCT
                                                                      实时荧光定量 PCR 结果采用 2               进行分析。
                              R：5′⁃ACACATTGGGGGTAGGAACA⁃3′
                                                                  采用SPSS 21.0统计软件，数据用均值±标准差（x ± s）
                  Q⁃CyclinD1  F：5′⁃TCGTTGCCCTCTGTGCCACA⁃3′
                                                                  表示，组间比较采用 t 检验或方差分析，P＜0.05 为
                              R：5′⁃AGGCAGTCCGGGTCACACTT⁃3′
                                                                  差异有统计学意义。。
                  Q⁃CDK4      F：5′⁃ACCAGGACCTACGGACATACC⁃3′
                              R：5′⁃TGCGAAGATACAGCCAACAC⁃3′
                                                                  2  结 果
                  Q⁃CDK6      F：5′⁃ACCTTCGAGCACCCCAACGT⁃3′
                              R：5′⁃ACCACAGCGTGACGACCACT⁃3′        2.1  SFN对LLC细胞增殖的影响
                  Q⁃CDK1      F：5′⁃TGCAGGACTACAAGAACACC⁃3′            利用CCK8检测了SFN 对小鼠肺癌细胞LLC 增
                              R：5′⁃GCCATTTTGCCAGAGATTCG⁃3′
                                                                  殖的影响，与对照组相比，随着处理时间增加，SFN处
                  Q⁃CyclinB1  F：5′⁃TGCTCTTGGAGACATTGG⁃3′
                                                                  理LLC细胞后增殖能力明显减弱。12.5 μmol/L SFN
                              R：5′⁃CAGGTTTTGGTAGGGCTT⁃3′
                                                                  处理细胞48 h后细胞数量较对照组减少，差异有统计
                1.2.6  细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）        学意义（P < 0.01），25.0 μmol/L SFN处理细胞24 h后
                检测                                                细胞数量软对照组减少，差异有统计学意义（P <
                    将对数生长期的 LLC 细胞接种于 6 孔板，每孔                     0.05，图1），表明SFN可以抑制LLC细胞的增殖。
                接种 5×10 个细胞，在 37 ℃含 5％C02培养箱中培养                   2.2  SFN对LLC细胞凋亡的影响
                         5
                24 h，分别加入12.5、25.0 μmol/L SFN，继续培养24、                 为研究 SFN 对 LLC 细胞凋亡能力的影响，细胞
                48 h。细胞用胰蛋白酶进行消化，PBS 清洗后，向                        计数培养 24 h 后，分别用 12.5 和 25.0 μmol/L 的 SFN
                200 μL细胞悬液中加入5 μL DCFH⁃DA，并在室温黑                   处理LLC细胞，用细胞凋亡试剂盒Annexin V⁃APC/7⁃
                暗条件下孵育30 min，离心，弃上清，用PBS洗2次。                      AAD 对 LLC细胞染色，结果发现，随着SFN浓度的增
                用流式细胞仪分析细胞，检测荧光变化情况。                              加，LLC细胞晚期凋亡比例逐渐升高，12.5 μmol/L的
                1.2.7 Western blot实验                              SFN 处理 LLC 细胞 24 h、48 h 的细胞凋亡率分别是
                    收集 SFN 处理的细胞，PBS 洗涤 2 次，去除上                   7.24%和 16.22%，25.0 μmol/L 的 SFN 处理 LLC 细胞
                清，每个样品加入100 μL RIPA+1 μL PMSF后放置冰                 24 h、48 h的细胞凋亡率分别是57.22%和75.12%（图

                上30 min，每隔10 min摇匀1次，然后在12 000 g 4 ℃              2），表明SFN可以促进LLC细胞的凋亡。
                离心 15 min，收集上清并用BCA 试剂盒检测其蛋白                      2.3  SFN对LLC细胞周期阻滞的影响
                浓度。每100 μL 样品加入25 μL 5×SDS⁃PAGE蛋白                     为了研究 SFN 对 LLC 细胞周期阻滞的影响，细
                上样缓冲液，混匀后100 ℃变性10 min。将蛋白样品                      胞计数培养24 h后，用SFN处理LLC细胞，流式细胞
                进行 SDS⁃PAGE，湿转至甲醇浸润过的 PVDF 膜上。                    术检测发现，25.0 μmol/L 的 SFN 作用 LLC 细胞 24 h
                用50 g/L脱脂奶粉溶液封闭1.5 h，PBST洗膜3次，每                   后，细胞周期分布出现了显著变化，处于 G1 期的细
                次10 min，加入一抗（1∶1 000），4 ℃摇床过夜；去除一抗                胞比例明显下降（P < 0.05），G2/M 期的细胞比例明
                液，用PBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1∶3 000），               显上升（P < 0.01，图3）。同时检测了细胞周期相关
                室温孵育1.5 h，PBST洗涤3次后采用ECL化学发光                      基因的表达量，25.0 μmol/L的SFN处理LLC细胞24 h
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